XIAP抑制剂增强依托泊苷对急性淋巴细胞白血病6T-CEM细胞凋亡诱导作用的研究

孙乐科 胡琳凤 史欣甜 冷尔玲

南昌大学附属人民医院儿科（南昌330006）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种儿童中最常见的恶性肿瘤，其中85%为B 淋巴细胞白血病，15%为T 淋巴细胞白血病［1］。近十多年来儿童白血病的治疗也取得较大的进展，五年生存率也达到80%［2］，但是仍有15%～20%患者会出现复发，并且出现耐药［3］。由于高强度的遗传毒性化疗药物的使用，部分ALL患儿还将诱发二次肿瘤以及其他健康问题，尤其是在T-ALL 中［4］。因此需要有效而且低毒副作用的治疗策略提高患儿的生存率以及生存质量。

X 染色体连锁的凋亡抑制（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）是一种细胞凋亡抑制因子，能选择性抑制细胞凋亡途径上游启动分子Caspase-9和下游效应分子Caspase-3，Caspase-7 的活性，抑制细胞凋亡并使细胞对化疗产生耐药［5-6］。AT-406是一种XIAP 蛋白的小分子化合物，通过与XIAP蛋白中BIR3 结构域竞争性结合，抑制与细胞凋亡蛋白Caspase-9 的结合，并且可以增强治疗敏感性［7］。通过抑制XIAP 的表达可以诱导白血病细胞凋亡［8-9］，然而XIAP 蛋白小分子抑制剂对ALL 细胞的抑制作用鲜有文献报道。因此，本研究将XIAP 作为克服耐药的理想靶标，通过XIAP 抑制剂AT-406 作用于T-ALL 细胞株6T-CEM，体外实验观察其对药物反应性的影响，并初步探讨其抗白血病作用机制，为XIAP 抑制剂的临床应用以及ALL 的临床治疗策略的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器XIAP 抑制剂AT-406（上海碧云天生物），人白血病6T-CEM 细胞株（武汉博士德公司），胎牛血清（杭州四季青），RPMI-1640 培养基（北京索莱宝公司），细胞培养板、细胞培养瓶和细胞培养皿（美国CORNING 公司），CCK-8 试剂盒（上海AbMole 公司），Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司），Caspase-3 酶活性检测试剂盒（南京凯基公司），兔抗人GAPDH、Caspase-3 一抗（美国abcam 公司），羊抗兔标记HRP 二抗（北京索莱宝公司），抗体稀释液和封闭液（上海碧云天生物），ECL 化学发光试剂盒（南京凯基公司），化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器），倒置光学显微镜（OLYMPUS 公司），CO2细胞恒温培养箱（日本三洋公司），酶标仪（美国Thermo 公司）；垂直电泳槽和转移电泳槽（美国BioRad 公司），流式细胞仪（美国Beckman 公司）。

1.2 细胞生长抑制率检测白血病6T-CEM 细胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液悬浮培养，选取对数生长期的6T-CEM 细胞并用10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液悬浮。细胞计数后调整细胞密度至1×106细胞/mL，XIAP 抑制剂AT-406按照说明书加入DMSO 溶解，单药组加入AT-406溶液使终浓度分别为0、0.1、1 和10 μmol/L，联合组中加入不同浓度AT-406 以及20 nmol/L 依托泊苷，混匀后铺种至96 孔细胞培养板中，每孔种植体积为100 μL。细胞培养板置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中常规培养24 h，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，孵育2 h 后用酶标仪检测OD450，每组设置3个复孔，分析不同浓度XIAP 抑制剂对6T-CEM 细胞的抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组OD值÷对照组OD值）×）组增殖。

1.3 细胞凋亡检测取对数生长期的6T-CEM 细胞，按1×106个/mL 的细胞密度接种于6 孔细胞培养板中。单药组分别加入终浓度为1 μmol/L 的AT-406 使和20 nmol/L 依托泊苷，联合组同时加入1 μM AT-406 和20 nmol/L 依托泊苷，对照组加入同体积DMSO。37 ℃，5% CO2条件下继续培养24 h 后，离心后去上清收集细胞，PBS 缓冲液清洗后加入预冷的1×Binding buffer 悬浮细胞，调整细胞密度，取0.5 mL 细胞悬液并加入5 μL PE-Annexin V 和10 μL 7-AAD，室温避光孵育15 min 后，用流式细胞仪上机检测。

1.4 Caspase-3 酶活性检测按照上述1.3 方法培养并收集细胞，收集细胞并用PBS 缓冲液清洗1次，离心收集细胞并用PBS 缓冲液清洗后，加入Lysis Buffer（含有DTT）于冰上裂解1 h，离心取上清后应用BCA 法进行蛋白浓度测定。按照说明书步骤取等量裂解液，加入PBS 补充体积到50 μL，加入50 μL 2×Reaction Buffer 和50 μL Caspase-3 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，用酶标仪于400 nm处测定其吸光度。OD实验组/OD对照组的倍数确定Caspase-3 的活化程度。

1.5 Western Blot 检测按照上述1.4 方法培养并收集细胞，离心收集细胞并用PBS 缓冲液清洗后，加入RAPI 裂解液（含有蛋白酶抑制剂PMSF）于冰上裂解1 h，离心取上清后应用BCA 法进行蛋白浓度测定。取20 μg 的蛋白上样至SDS-PAGE凝胶孔道中，并进行电泳，采用半干转膜法将蛋白转移至PVDF 膜上，转膜结束后将PVDF 膜置于封闭液中，室温封闭1 h。按照抗体说明书中建议的使用浓度，用抗体稀释液配置一抗工作液，并将PVDF 膜置于工作液中4 ℃孵育过夜；PBST 缓冲液PVDF 膜后，置于二抗工作液中室温孵育2 h；PBST缓冲液漂洗后进行显影；用Image J 图像分析软件分析格条带的光密度值，并计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法数据采用Graph Pad Prism 7 软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差表示，应用非配对t检验比较两组间的差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 XIAP 抑制剂AT-406 增强依托泊苷对6TCEM 细胞的生长抑制作用CCK-8 比色法检测不同浓度的AT-406 单药以及联合20 nmol/L 依托泊苷对6T-CEM 细胞增殖的影响，检测结果显示0.1、1、10 和100 μmol/L 的XIAP 抑制剂AT-406 处理6TCEM 细胞24 h 后的抑制率分别为（4.19±1.96）%、（8.01±0.17）%、（10.03±1.74）%和（14.77±1.50）%。依托泊苷联合不同浓度AT-406 为（27.33±5.00）%、（33.32±1.88）%和（37.27±2.16）%，明显高于依托泊苷单药处理组（13.18±3.61）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果提示XIAP 抑制剂AT-406 可以增强依托泊苷对6T-CEM 细胞的生长抑制作用（图1）。

2.2 XIAP 抑制剂AT-406 诱导6T-CEM 细胞凋亡流式细胞仪检测1 μmol/L 浓度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷单药以及联合处理6T-CEM 细胞24 h 后细胞凋亡诱导情况。结果显示1 μmol/L 浓度AT-406、20 nmol/L 依托泊苷以及联合组的细胞凋亡率（Annexin V 阳性细胞比率）分别为（17.5±1.86）%、（43.7±3.91）%、（66.0±2.08）%，明显高于对照组（12.0±2.14）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；结果提示XIAP 抑制剂AT-406 可以促进依托泊苷对6T-CEM 细胞凋亡的诱导作用，见图2。

2.3 XIAP 抑制剂AT-406 增强6T-CEM 细胞Caspase-3 中酶活性6T-CEM 细胞经1 μmol/L 浓度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷单药以及联合处理24 h后，应用比色法测定Caspas-3 酶活性，结果显示AT-406 单药组中Caspas-3 酶活性高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；依托泊苷单药组以及联合处理组中Caspas-3 酶活性明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；联合处理组中Caspas-3 酶活性明显高于依托泊苷单药组对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。结果表明XIAP 抑制剂可以增强依托泊苷均对细胞中Caspase-3 酶活性的激活作用。

图1 AT-406 和依托泊苷对6T-CEM 细胞的生长抑制作用Fig.1 The effects of AT-406 and etoposide on growth inhibition rate of 6T-CEM cells

图2 AT-406 增强依托泊苷对6T-CEM 细胞凋亡的诱导作用Fig.2 AT-406 enhances the effect of etoposide on apoptosis of 6T-CEM cells

2.4 XIAP 抑制剂AT-406 诱导6T-CEM 细胞Cleaved-Caspase-3 蛋白的表达6T-CEM 细胞经1 μmol/L 浓度的AT-406、20 nmol/L 依托泊苷单药以及联合处理24 h 后，Western Blot 检测细胞中Caspase-3 活化状态Cleaved-Caspase-3 的蛋白表达水平。结果显示XIAP 抑制剂单药处理组中Cleaved-Caspase-3 水平与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；依托泊苷单药以及联合处理组中Cleaved-Caspase-3 表达水平明显上调，而且联合组中Cleaved-Caspase-3 表达水平高于依托泊苷单药处理组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图3 AT-406 增强依托泊苷对6T-CEM 细胞中Caspase-3 酶活性的激活作用Fig.3 AT-406 enhances the activation of Caspase-3 enzyme activity in 6T-CEM cells by etoposide

图4 AT-406 增强依托泊苷对Cleaved-Caspase-3 蛋白的上调表达的诱导作用Fig.4 The effect of AT-406 on the expression of Cleaved-Caspase-3 protein in 6T-CEM cells

3 讨论

在T 细胞分化过程中，癌基因异常激活、抑癌基因的缺失表达，将导致细胞分化阻滞和免疫细胞克隆性扩增，最后导致T-ALL 的形成。这种血液肿瘤具有高度异质性，具有广泛的遗传缺失和表观遗传学改变，共同促使T 细胞恶性转变。T-ALL 在儿童ALL 中总体存活率为85%～90%，主要表现纵隔肿块和髓外淋巴结以及其他部位出现浸润，例如中枢神经系统［10］。目前T-ALL 的治疗方案仍为大剂量的化疗，高危及难治患儿选择造血干细胞移植。在诱导化疗期间，大量白血病细胞将通过糖皮质激素、天冬酰胺酶和长春新碱联合治疗得到根除［11］。

Notch1被认为是T-ALL发生发展过程中最重要的基因之一，因为其在50%以上的T-ALL 患者中均检测到突变［12］。T-ALL中持续激活的Notch1可以通过调控IKK复合物以及转录水平激活NF-кB信号途径［13］。在对B细胞慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）的研究中发现Notch1信号途径持续激活，同时伴随这NF-кB信号途径的活化以及下游抗凋亡蛋白的上调表达，例如细胞抑制蛋白-2（c-IAP2）和XIAP［14］。XIAP 作为NF-кB 信号途径转录调控的靶基因，对TNF-α诱导的细胞凋亡过程具有抑制作用［15-16］。因此，NF-кB可能作为重要的介导因子参与Notch突变诱导的T-ALL 形成过程，并参与白血病细胞的存活和抗凋亡进程，抑制NF-кB 信号途径以及下游信号分子可能作为重要的靶标用于临床治疗。

X-连锁凋亡抑制因子（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）其通过与半胱天冬酶（Caspase）相结合并抑制酶活性。然而，XIAP 还参与其他不依赖于Caspase 抑制作用的细胞进程［17］。肿瘤细胞中表达一种或者多种IAP 家族蛋白，是表现出抗凋亡作用的机制之一。XIAP 作为IAP 家族成员之一可以直接与Caspase 结合（Caspase-9、Caspase-7和Caspase-3），从而抑制内源性或者外源性细胞凋亡途径。鉴于其抗凋亡作用，并且在多种肿瘤中表达特征，通过小分子化合物抑制其Caspase 结合能力也作为靶向治疗的新思路。

本研究中CCK-8 实验显示XIAP 抑制剂对6T-CEM细胞是具有生长抑制作用，实验结果显示，在0.1～100 μmol/L 终浓度的XIAP 抑制剂AT-406都会抑制细胞的生长，AT-406 联合依托泊苷后可明显增强其生长抑制作用。流式细胞术分析细胞凋亡，实验结果显示1 μmol/L 终浓度的XIAP 抑制剂AT-406 和20 nmol/L 的依托泊苷处理6T-CEM 细胞后Annexin V 阳性细胞比例明显高于对照组，联合处理组中凋亡率明显高于依托泊苷单药组，提示XIAP 抑制剂AT-406 可以增强依托泊苷对6TCEM 细胞的凋亡诱导作用。XIAP 蛋白的BIR3 结构域结构域可以与细胞凋亡途径中的起始因子Caspase-9 结合，从而抑制包括内源性和外源性细胞凋亡途径联级反应的活化，从而抑制细胞凋亡进程［5］。因此，本研究还通过比色法分析细胞凋亡途径联级反应下游蛋白Caspase-3 的酶活性，实验结果显示XIAP 抑制剂AT-406 处理6T-CEM 细胞后，Caspase-3 的酶活性与对照组相比差异无统计学意义。在正常情况下，Caspase-3 在细胞质中的无酶活性，并广泛分布于各种不同类型的细胞和组织中，只有在细胞受到内源性或者外源性细胞凋亡信号诱导后，并激发细胞凋亡途径联级反应。作为Caspase 家族中最重要的细胞凋亡执行者，Caspase-3 被剪切后激活，进而诱导细胞发生凋亡。在依托泊苷单药和联合处理组中Caspase-3酶活性明显上升，联合组Caspase-3 酶活性明显高于依托泊苷单药组，结果提示依托泊苷处理将激活细胞凋亡信号，XIAP 抑制剂可以增强细胞凋亡执行者Caspase-3 酶活性。本研究通过Western Blot 实验检测活化状态的Caspase-3，即Cleaved-Caspase-3 在细胞中的表达水平。实验结果显示，6T-CEM 细胞经XIAP 抑制剂AT-406 处理后，联合处理组中Cleaved-Caspase-3 的表达水平明显高于依托泊苷单药组，实验结果与Caspase-3 酶活性检测结果一致，以上实验结果说明依托泊苷处理可以激活细胞凋亡途径，AT-406 可以增强凋亡途径中Caspase 联级反应和细胞凋亡进程。

综上所述，XIAP 抑制剂对急性淋巴细胞白血病6T-CEM 细胞的增殖具有抑制作用，通过抑制XIAP 蛋白并激活依托泊苷诱导的Caspase 酶活性，促进细胞凋亡进程。本研究结果提示XIAP 抑制剂可作为抗肿瘤药物增敏剂，加强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，可能为复发难治T-ALL 患者的临床治疗提供理论基础和新的思路。然而，目前尚未进行ALL 动物模型的体内研究，下一步将建立ALL 小鼠模型，并确定XIAP 抑制剂在体内的有效性和安全性。