暗褐网柄牛肝菌菌种不同保藏方法的效果研究

何明霞，刘 静，杨天伟，许欣景，高 锋，方艺伟，王文兵，张春霞

（云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100）

暗褐网柄牛肝菌Phlebopus portentosus（Berk. & Broome ) Boedijn，俗名黑牛肝菌，隶属于牛肝菌目Boletales 小牛肝菌科Boletinellaceae，我国主要分布于云南、四川、广西和海南等地［1-3］，国外分布于泰国和斯里兰卡，越南、印度尼西亚、巴西、墨西哥、澳大利亚和新西兰有近似种分布［4-5］。暗褐网柄牛肝菌子实体品质鲜嫩，味道鲜美，肉质细腻，营养价值丰富，是珍稀美味食用菌之一［6-7］，其菇房人工栽培及经济果林下仿生栽培都已成功［8］。

菌种质量的优劣不但直接关系到食用菌栽培的产量和质量，甚至会影响到生产的成败。暗褐网柄牛肝菌菌种是其人工栽培和仿生栽培的关键环节之一，如何使暗褐网柄牛肝菌菌种保持原有的遗传性状不变异、不退化，在科研工作和产业化中都有着重要意义。暗褐网柄牛肝菌属于高温担子菌，菌丝对低温很敏感，在低温条件下会发生自溶而死亡，菌丝生长的最适温度是28～30℃，温度低于15℃或超过30℃，菌丝生长速度会急剧下降［9］，这也表明暗褐网柄牛肝菌难以像其他的菌种一样在0～5℃条件下长期保藏。生产上常用的传代培养保藏法是将菌种置于15～20℃条件下保藏，每隔3～6 个月转管1 次，这一技术提供了一个简便有效的短期保藏方法，但也增加了菌种产生污染和形态、生理特征发生变异的风险。本试验研究了不同的菌种保藏方法对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长及出菇的影响，以期筛选出高效、低成本、易操作的保藏方法。

1 材料和方法

1.1 供试菌种

由收集的野生暗褐网柄牛肝菌分离纯化，通过出菇试验后筛选出的优良菌株Cy4［10］，保存于云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用中心。

1.2 培养基

1.2.1 暗褐网柄牛肝菌母种及菌丝活化培养基

M1 培养基［4］：葡萄糖20.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g、酵母膏2.0 g、马铃薯200.0 g、琼脂20.0 g、水1 L。 灭菌条件：0.15 MPa，121℃，30 min。

1.2.2 栽培种培养基［8］

橡胶木屑63%（w/w），红土粉11%（w/w），谷粒25%（w/w），碳酸钙1%（w/w）。灭菌条件：0.15 MPa，121 ℃，灭菌120 min。

1.3 方法

试验设4 个处理：

A.蒸馏水15℃保藏：将暗褐网柄牛肝菌试管种切取约3 mm 大小的菌丝块，放入装有5 mL 无菌蒸馏水的试管（150 mm×15 mm）中，每试管接入5 个菌丝块，置于15℃生化培养箱保藏。

B.蒸馏水室温保藏：同上，室温保藏。

C.5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏：在装有2 mL 5%海藻糖+20%甘油保护剂的冻存管中放入3 个菌丝块，置于-80℃生化培养箱保藏。

D.斜面种15℃保藏：试管种长满后，放置于15℃生化培养箱中保藏。

1.3.1 菌丝培养

菌种保藏12 个月后，挑取各处理菌丝块接种于M1 培养基上，转接活化后，用6.5 mm 打孔器打孔，然后挑取菌块接入M1 试管培养基（试管为200 mm×25 mm），每试管3 个接种块，每个处理5次重复。28℃恒温暗光培养，观察记录菌丝萌发时间、菌落颜色、有无菌核、菌丝长势，菌丝长满试管时间。超低温保藏菌种的解冻方法为先从-80℃超低温冰箱取出，放入37℃水浴锅里解冻，解冻后用灭菌滤纸将菌丝块吸干。

1.3.2 栽培出菇

将长满试管的供试菌种接种于液体M1 培养基中培养，每瓶接种6.5 mm 的菌饼30 个，静置一晚后，于28℃恒温、暗光、130 r/min 振荡培养7 d，然后将液体菌种接到装有栽培基质的菌袋里，置于28～30℃暗光培养，每处理接种60 袋。记录菌丝满袋时间，观察菌丝长势，待菌丝长满菌袋，覆土移入出菇房培养，记录出菇时间、子实体成熟袋数、单菇重。

1.3.3 试验数据处理

数 据 以“ 平 均 值± 标 准 差”表 示。 应 用SPSS 23.0 统计分析软件处理，采用one-way ANOVA（LSD）进行试验数据方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同保藏方法对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响

由表1 可知，4 种不同保藏方法的菌丝萌发时间有差异。蒸馏水15℃保藏，菌丝萌发所需时间最短，为（4.20±0.28）d，菌落黄褐色，菌丝粗壮、致密；菌丝萌发所需时间最长的是蒸馏水室温保藏，为（6.50±0.89）d，菌落灰黄色，菌丝较浓密。4 种不同保藏方法都能产生暗褐色的菌核。蒸馏水15℃保藏，菌丝长满试管时间最短（13.50±2.13）d，长满试管时间最长的是蒸馏水室温保藏，需（18.50±2.60）d，二者差异显著（P＜0.05）。

表1 不同保藏方法对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响

2.2 不同保藏方法对栽培种暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响

由表2 可知，4 种不同保藏方法的暗褐网柄牛肝菌菌丝在培养料中生长有较大的差异。蒸馏水15℃保藏与其它3 种处理差异显著，菌丝长满菌袋的时间最短（27.14±1.57）d，菌丝浓密、粗壮，菌核数量多；其次为斜面种15℃保藏，菌丝长满菌袋的时间（31.14±0.90）d，5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏和蒸馏水室温保藏，菌丝长满菌袋需（33.14±0.90）d 和（33.71±1.70）d。

2.3 不同保藏方法对暗褐网柄牛肝菌出菇的影响

从表3 可知，蒸馏水15℃保藏、5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏，覆土后出菇时间较短，仅需（13.86±1.08）d、（14.29±0.76）d，与其它2 种保藏方法差异显著（P＜0.05）；蒸馏水15℃保藏、5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏，子实体成熟率分别达到98.50%、92.40%，其他2 种保藏方法子实体成熟率分别为55.70%、62.80%。子实体平均单菇最重的是蒸馏水15℃保藏，重量为（94.54±1.26）g，与其他3 种保藏方法差异显著（P＜0.05）。蒸馏水室温保藏子实体重量最轻，仅为（68.57±2.16）g。

3 结论与讨论

暗褐网柄牛肝菌属于高温食用菌，菌丝最适生长温度为28～30℃，低于15℃时菌丝生长受到抑制。李希政等［11］采用4℃冰箱冷藏和室内常温两种方式保存黑牛肝菌菌种，结果发现4℃冰箱冷藏6 个月后的黑牛肝菌菌丝成活率仅为15%，转管成活率极低；而室内常温保存的菌种，成活率为94%，菌丝老化失活现象较少，因此，黑牛肝菌菌种保藏建议采用室内常温保存方法；但对于暗褐网柄牛肝菌菌种长期保存，单纯的室内常温保存方法并非最佳选择。

本文通过研究不同保护剂、温度等条件对暗褐网柄牛肝菌菌种长期保藏效果的影响，结果显示：蒸馏水15℃是暗褐网柄牛肝菌菌种长期保藏的最佳方法，保藏12 个月后，菌丝萌发快，只需（4.20±0.28）d，菌丝黄褐色、致密、粗壮；菌丝长满试管时间短，为（13.50±2.13）d；栽培菌袋菌丝满袋时间短（27.14±1.57）d，覆土后（13.86±1.08）d 就可出菇，子实体平均单菇重（94.54±1.26）g。

菌种保藏是食用菌栽培生产的重要工作之一，不同的食用菌需寻找适宜的菌种保藏方法。Karaduman 等［12］研究发 现，20℃是裂 褶菌较好的短期保藏温度。张丹等［13］通过正交实验分析出适宜金针菇菌种中短期保存的方法，认为温度是金针菇菌种保藏的重要影响因子，20℃是短期（1～6 个月）菌种保藏的最佳方式，当菌种保藏时间需超过6 个月时，应采用-80℃低温保藏；另外发现甘油、海藻糖、甘露醇均有利于金针菇菌种的中短期保藏，与本研究中采用5%海藻糖+20%甘油-80℃保藏暗褐网柄牛肝菌菌种的效果仅次于蒸馏水15℃保藏的结果一致。