基于整合药理学探究中药方剂治疗勃起功能障碍核心药物的作用机制*

孙占东 刘 嘉 曾明月 曾庆琪,3

1. 江苏卫生健康职业学院（江苏南京 211800）；2. 北京中医药大学（北京 100029）；3. 南京中医药大学第一附属医院（江苏南京 210029）

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED），中医称之为阳痿，是临床男科常见的性功能障碍疾病之一[1]。中医学认为阴茎不能勃起,或勃而不坚，或坚而不久,皆属于该病的临床表现[2]。中医药对其防治具有悠久的历史，有着较为完整的理论架构和特有的治疗手段[3]。《中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂》(简称《中药成方制剂》)[4]中收录不少于百种的中药方剂，但目前的科学研究中，对于中药治疗勃起功能障碍的组方用药规律，组方核心药物的挖掘，药物的成分、靶标，分子内在的作用机制等相关研究较少，未能较好的在微观层面阐明中医药治疗疾病的机理机制。

整合药理学是中药现代研究新模式,药理学研究的新领域。由中国中医科学院中药研究所开发的“中医药整合药理学研究平台v2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine v2.0,TCMIP V2.0）”，包含了中药材、中药方剂、中药成分、中药靶标、 疾病相关分子等五大数据库资源[5]，可用于揭示中医药理论的科学内涵、挖掘组方用药经验、阐释中药作用原理、分析中药药理效应等研究，为中医药的现代化研究提供强有力的数据支撑和分析平台。本研究基于TCMIPv2.0 平台，分析中医药治疗勃起功能障碍方剂的核心用药，阐释药物的药效物质基础（主要成分、靶点）及作用机制，为临床及科研的深入开展提供一定的理论依据。

资料与方法

一、方剂收集录入

中医药整合药理学研究平台（http：//www.tcmip.cn/）中药方剂数据库中收录了《中药成方制剂》记载的方剂数据，包括方剂名称、药物组成、功效疾病、主治证候等信息。利用该平台，按指定疾病“阳痿”提取数据库中的方剂信息。

二、核心药物数据挖掘

中药治疗勃起功能障碍的核心药物由“高频次单味药材（药物在所有方剂中出现次数大于20%）”与“高频次药组（药组在所有方剂中出现次数大于20%）”的交集组成。通过中医药整合药理学研究平台“组方用药规律分析”模块，对获取到的方剂进行数据分析，包括处方中所含药物频次统计、组方规律。高频次单味药材的获取，应用“组方中药的频次统计”选项，可一键化获得各味中药的用药频次，选取用药次数大于总方剂数×20%的药物；高频次药组的获取，应用“组方中药的关联性分析”选项，该功能基于关联规则算法，分别设置“2味、3 味、4 味”药组，计算相应药组频次，选择频率大于20%的药组作为数据结果。

三、中药化学成分来源

在中医药整合药理学研究平台-中药材数据库，对核心药组药物进行检索，收集所有化学成分，建立中药治疗“勃起功能障碍”核心药组化学成分数据库。

四、中药靶标预测及GO 富集分析

利用中医药整合药理学研究平台中的“中药（含方剂）靶标预测及功能分析”模块，依次输入核心药组药物名称，即可对核心药组的药物进行靶标预测及GO富集分析。该模块针对中药化学成分和FDA 上市药物进行相似性打分，获取高可信度（Similar Score>0.8）的中药候选靶标谱，可进一步阐释中药作用机理。

五、疾病相关基因集获取

TCMIP V2.0 平台整合了疾病 “基因相关性数据库”（DisGeNET）、“人 类 表 型 本 体 数 据 库”（HPO）、“Drugbank 数据库”、“治疗靶标数据库”（TTD）等资源，构建起疾病和常见临床表型相关基因数据库。在TCMIP V2.0 平台疾病相关分子集及其功能挖掘模块，以“erectile dysfunction”作为关键词，通过检索可获取勃起功能障碍疾病的相关基因。

六、 中药- 疾病核心靶标蛋白质相互作用网络及生物通路分析

通过整合药理学平台的“中医药关联网络挖掘”模块，该 模 块 镶 嵌 了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase 等包含蛋白质- 蛋白质相互作用数据的数据库，可构建中药与勃起功能障碍核心靶标的蛋白互作网络(protein protein interaction network,PPI network)。应用Cytoscape 3.4 软件绘制网络图。同时，该模块整合了Reactome（https://reactome.org/）[6]生物通路数据库，可对获得网络中包含的所有基因参与的生物通路进行分析。

结 果

一、中药治疗勃起功能障碍核心药物结果

应用平台中的中药方剂数据库，共计获得治疗勃起功能障碍方剂127 首，包含280 味中药材。对各味中药在方剂中出现的频率进行统计，提取频率大于20%的药材从高到低进行列出。分别为枸杞子（72 首，57.6%）、菟丝子（62 首，49.6%）、熟地黄（61 首，48.8%）、淫羊藿（60首，48%）、肉苁蓉（47 首，37.6%）、当归（43 首，34.4%）、人 参（42 首，33.6%）、山 药（38 首，30.4%）、补 骨 脂（37首，29.6%）、茯苓（36 首，28.8%）、五味子（36 首，28.8%）、杜仲（35 首，28%）、巴戟天（34 首，27.2%）、黄芪（28 首，22.4%）、牛膝（26 首，20.8%）。药物组合频率大于20%的药组，分析结果如表1 所示。综合高频次单味药与高频次药组结果，确定中药治疗勃起功能障碍的核心药物为枸杞子、熟地黄、肉苁蓉、菟丝子、山药、淫羊藿、杜仲、茯苓、当归、巴戟天、人参、补骨脂、五味子。

表1 治疗勃起功能障碍方剂药物组合频率大于20%药组

二、核心药物化学成分

基于TCMIP V2.0中的中药材数据库，依次分析核心药物的化学成分。枸杞子收集到化学成分57 个，主要为多糖、氨基酸、生物碱、挥发油等；熟地黄收集到化学成分12 个、主要为糖类、谷甾醇、核苷等；肉苁蓉收集到50 个化合成分，主要为肉苁蓉苷、生物碱、氨基酸等；菟丝子收集到化学成分8 个，主要为糖苷、胡萝卜素、山奈酚等；山药收集到45 个化合成分，主要为甘露糖、多巴胺、氨基酸等；淫羊藿收集到化学成分27 个，主要为黄酮类化合物、淫羊藿苷、棕榈酸等；杜仲收集到化学成分52 个，主要为黄酮类、环烯醚萜、甾体和萜类等；茯苓收集到33 个化学成分，主要为多糖、脂肪酸、甾醇类等；当归收集到65 个化学成分，主要为挥发油、酚酸类、黄酮类等；巴戟天收集到19 个化学成分，主要为糖类、谷甾醇、胡萝卜苷等；人参收集到158 个化学成分，主要为皂苷类、多糖类、有机酸等；补骨脂收集到32 个化学成分，主要为香豆素类、黄酮类、单萜酚类等；五味子收集到99 个化学成分，主要为木脂素类、有机酸、挥发性油等。

三、中药靶标预测及GO 富集分析结果

中药化学成分复杂，且已知作用靶点有限，通过获得更多且可靠性高的靶标是研究中药作用原理的关键问题[7]。基于Tcmip V2.0 中的中药（含方剂）靶标预测及功能分析模块可以获得每味核心药物的靶标，并且对预测出的靶标进行GO 功能富集分析。枸杞子获得靶标基因235 个、熟地黄获得靶标基因656 个、肉苁蓉获得靶标基因326 个、菟丝子获得靶标基因101 个、山药获得靶标基因898 个、淫羊藿获得靶标基因200 个、杜仲获得靶标基因338 个、茯苓获得靶标基因232 个、当归获得靶标基因334 个、巴戟天获得靶标基因235 个、人参获得靶标基因1283 个、 补骨脂获得靶标基因255个、五味子获得靶标基因94 个。对各个药物的靶标基因取交集，13 位中药共同作用的靶标基因为AR （雄激素受体） 基因。对核心药物靶点基因进行GO 富集分析，结果如表2 所示。

表2 核心药物靶点基因GO 富集分析结果

四、疾病相关基因集获取结果

基于TCMIP V2.0平台疾病相关分子集及其功能挖掘模块，输入疾病关键词后，共获得勃起功能障碍疾病基因17 个，见表3。

表3 勃起功能障碍疾病相关基因

五、中药-疾病蛋白质相互作用网络及生物通路分析结果

应用TCMIP V2.0平台中的中医药关联网络挖掘模块，可构建中药靶标与疾病靶标蛋白质互作网络，并可对网络中的基因进行深入的生物通路分析。基于平台中的蛋白数据库，核心药物与勃起功能障碍疾病构建的核心靶标网络中包含108 个基因，其中中药基因101 个，疾病基因10 个，共同基因3 个。蛋白互作网络如图1 所示。对核心靶标蛋白互作网络进行生物通路分析，显著富集的前20 条通路结果如图2 所示。

图1 中药与疾病核心靶标蛋白互作网络图

图2 中药与疾病核心靶标生物通路富集分析结果（●为前20 条生物通路）

讨 论

由于中医药治疗勃起功能障碍的方剂较多，配伍较为灵活，靶点众多，对其治疗疾病的作用机制一直是科学研究的重、难点[8]。本研究采用挖掘组方规律与整合药理学的方法，对《中药成方制剂》中治疗男科勃起功能障碍疾病的方剂进行收集，挖掘方剂核心药物的作用机制和药效物质基础，并进行了深入的药理学分析，为中药方剂治疗疾病的机理机制研究提供了新思路。

通过对《中药成方制剂》中勃起功能障碍方剂的组方规律分析，从127 味中药中挖掘出13 味核心药物。其中居于前三位的单味药为枸杞子、菟丝子、熟地黄；前三位药对为枸杞子—菟丝子、枸杞子—熟地黄、熟地黄—菟丝子，与方剂“右归丸”中部分药物相吻合。“右归丸”是治疗阳痿遗精、肾阳不足的经典名方[9]。结合该三味药物的特性可知，中医对于勃起功能障碍的治疗首选温补肾阳、益气养血之品[10]。对13 味药物进行四气五味归经分析，发现四气中温性药占主体，有9 味药属温性（肉苁蓉、淫羊藿、杜仲、当归、巴戟天、熟地黄、人参、补骨脂、五味子），其余4 味皆属平性（枸杞子、菟丝子、山药、茯苓）；五味中甘味占多数，只有淫羊藿属苦味、补骨脂属辛味，其余药材或属纯甘味，或属甘、苦，甘、咸，甘、辛味。归经分析发现，除当归属心经、肝经、脾经，其余12 味药物皆含肾经，并与肝经、脾经、肺经、心经、 大肠经密切相关，说明药物的作用以肾经为根本，协同体内其他脏器共同作用，产生滋肾壮阳、补血养阴、精气充髓、活血通络等功效，针对勃起功能障碍疾病表现出的肾虚肝郁、气滞血瘀、湿热下注、阴虚火旺等证，发挥特定的治疗作用。

对于核心药物化学成分的分析，再次证明了中药具有多成分，且不同中药具有相同成分的特性[11]。在用药过程中，药物的作用是复杂的多对多关系。以淫羊藿为例，该药物以黄酮类化合物为主要成分，能够影响下丘脑—垂体—性腺轴、肾上腺皮质轴等内分泌系统，其提取液能已被证明能够通过血睾屏障,在生殖系统中发挥作用[12]。在当归、补骨脂、杜仲等中药中也具有黄酮类成分。从而可知，核心药物中所含的某些化学成分与勃起功能障碍疾病密切相关，为中医临床药物的选择提供了科学依据。进一步对药物化学成分的作用靶标进行分析，发现每位中药的靶标数各不相同，但由于不同中药之间具有相同的化学成分，以致不同药物具有部分相同的靶标，说明在基因作用层面，药物仍存在协同作用的关系[13]，药物的协同作用有效增强了药效，对于疾病的治疗起着积极促进的作用。13 味核心药物唯一共同作用的靶标为AR（androgen receptor，雄激素受体）基因，该基因与体内雄激素的形成密切相关，是雄激素作用的中介物质，能够使细胞的功能发生改变，具有促进细胞分化和组织器官的发育等功能[14]。以此可推断，13 味核心药物对于勃起功能障碍疾病的治疗，可能与调控体内某些关键基因（如AR 基因）密切相关。通过对核心药物全部靶点基因的GO 富集分析，发现药物主要参与氧化还原过程、药物反应脂质代谢过程、类固醇代谢过程、 类固醇激素介导的信号通路等一系列生物过程，在线粒体、神经元、髓鞘、突触后膜等细胞位置，起到氧化还原酶的激活、药物绑定、催化活性、核苷酸绑定、核受体的活动等分子作用。

通过对中药与疾病核心靶点蛋白相互作网络的构建，可清晰的看出药物作用靶标与疾病作用靶点之间的复杂网络关系。在已知的药物基因与勃起功能障碍基因之间，存在多对多的作用，既有共同相互作用的基因，也有独立调控的基因。通过进一步的网络功能分析，发现蛋白作用网络主要通过复合生物合成、protein kinase A（PKA）激活、腺苷酸环化酶激活途径、Tumor Protein p53 （TP53)调节代谢、 胰高血糖素信号转导中PKA 的激活、 胰高血糖素信号在代谢调节中的作用、Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）介导的血管通透等生物过程，在体内产生治疗勃起功能障碍疾病的作用。药物与疾病的作用在微观层面是复杂的，涉及多过程、多成分、多反应，对于药物治疗勃起功能障碍的核心作用过程，仍需开展深入的实验验证。

综上，本研究利用整合药理学方法从药材—成分—靶标—通路—疾病等不同层面，深入开展了中药方剂治疗勃起功能障碍方剂核心药物的作用机制研究，较为清晰的阐明了中药药物在治疗勃起功能障碍疾病过程中发挥的中药作用。同时，本研究也为中药方剂治疗男科疾病的作用机制研究提供新思路与方法，进而推进中医药治疗男科疾病的现代化。