不同源性精子经ICSI-ET 助孕术后的临床结局及子代安全性研究

贺 晓 李 博 孙 丹 黄剑磊

空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心（陕西西安 710038）

自1992年卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术[1]问世以来，男性不育问题在临床上得到了革命性的突破。对于严重少精症、严重弱精症及严重畸形精子症患者，均可以通过ICSI 技术解决生育的问题； 而随着显微取精技术的发展，附睾穿刺取精及睾丸穿刺取精技术的发展解决了梗阻性无精症患者或部分睾丸性无精症患者的不育难题，在取得精子后也可以通过ICSI 技术获得和自己有血缘关系的后代。但是附睾/睾丸穿刺取出的精子和射出精子经过ICSI 技术后子代安全性方面的研究较少，样本量一般也较小。故而本研究选择了2017年1月至2019年5月于空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心行ICSI-ET 助孕并行新鲜周期移植患者共1248 个周期为研究对象，比较分析附睾/睾丸来源的精子和射出精子在ICSI 技术助孕后临床结局及子代安全性方面有无差异。

资料和方法

一、研究对象

采用回顾性队列研究，选择2017年1月至2019年5月于空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心行ICSI-ET 助孕并行新鲜周期移植患者为研究对象，共1248 个周期。根据取卵当日男方的取精方式分为两组：手术取精组，即男方行附睾/ 睾丸穿刺取精组，共230个周期；对照组，即射出精子组，共1018 个周期。

纳入标准：（1）新鲜胚胎移植的ICSI-ET 周期，按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版标准[1]：精子浓度＜5×106/ml 或精子活动率中前向运动PR≤5%或正常精子形态学≤1%；或连续2 次以上精液常规离心沉淀后未见精子，行诊断性附睾/睾丸穿刺可取到精子者；（2）女方年龄＜35 岁；（3）控制性超促排卵方案为黄体期长方案或拮抗剂方案；（4）新鲜精子及卵子受精周期。

排除标准： 排除同时合并以下情况的治疗周期：（1） 子宫内膜异位症患者；（2） 明确输卵管积水患者；（3）复发性流产患者；（4）多发性子宫肌瘤患者、宫腔粘连、 子宫内膜息肉及子宫畸形等子宫异常因素；（5）卵巢早衰患者；（6）补救性ICSI 治疗周期；（7）遗传学诊断/筛查（PGS/PGD）周期。

二、方法

1. 控制性超促排卵与ICSI-ET：ICSI-ET 治疗方案按照本中心诊疗常规进行。

黄体期长方案于月经周期第18-21 天开始予皮下注射醋酸曲谱瑞林注射液（达必佳，辉凌，瑞士，0.1 mg/支）0.05 mg～0.1 mg/ 天，连用12～14 天后开始卵巢刺激；拮抗剂方案于月经周期第2～3 天开始卵巢刺激，根据血清雌二醇水平、LH 水平及卵泡直径灵活添加拮抗剂 （思则凯，默克雪兰诺，德国，0.25mg/ 支）0.125mg～0.375mg/天。基于患者年龄、体重、卵巢储备情况选择个体化卵巢刺激的启动剂量。主要选择重组人促卵泡激素注射液（果纳芬，默克雪兰诺，德国）或者重组促卵泡素β 注射液（普丽康，默沙东，美国）100 U-300 U/ 天，必要时添加注射用尿促性素（乐宝得，珠海丽珠）或重组人促黄体激素（乐芮，默克雪兰诺，德国）75～150U/ 天；当卵泡直径≥18mm 的卵泡数目≥3个时给予注射用绒促性素JY （丽珠，珠海）5000～10000U 或注射用重组人促性素（艾泽，默克雪兰诺，德国）250ug 扳机，注射后36～38h 行阴道超声引导下取卵术。

取卵术后4-6h 脱颗粒及ICSI 注射，取卵术后72h后行胚胎移植术，移植胚胎数≤2 枚（单囊胚移植或双卵裂期胚胎移植）。取卵手术当日开始给予黄体酮注射液20mg/ 天，取卵后第2 天开始予阴道用黄体酮凝胶（雪诺同，默克雪兰诺，德国）1 枚/ 天；胚胎移植术后继续上述用药行黄体支持。

2. 妊娠结局判定： 胚胎移植术后14 天查血HCG值，当血HCG＞10 U/L 时为HCG 阳性；胚胎移植术后25 天～30 天首次超声检查确定有孕囊者诊断为临床妊娠，同时确定孕囊的个数和位置。

3. 观察指标：包括一般情况参数、促排卵及实验室参数、ICSI-ET 的妊娠结局及围产期结局。ICSI 受精率= （2PN 卵子数+1PN 卵子数+多PN 卵子数）/注射MⅡ卵子总数×100%；ICSI 正常受精率=D1 出现的2PN卵子数/注射MⅡ卵子总数×100%；卵裂率=卵裂胚胎数/受精卵子数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%； 多胎率=双胎或多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率=孕12 周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；胎儿畸形引产率=因胎儿畸形引产周期数/ 临床妊娠周期数×100%；活产率=活产的分娩数/ 移植周期数×100%；剖宫产率=剖宫产周期数/活产周期数×100%；＜37 周早产率=＜37 活产周期数/活产总周期数×100%。

我中心优质胚胎的标准：在正常受精的前提下，D3胚胎细胞数7～9，碎片率＜20%，评分≥2 分；根据Gardner 评分标准，3 期及3 期以上且内细胞团和滋养层评分不含C 的囊胚。D3 可利用胚胎指受精后第3 天可移植和冷冻的胚胎总和；可利用囊胚指根据Gardner 评分标准，3 期及3 期以上且内细胞团和滋养层评分不同时含C 的囊胚。

三、统计学方法

应用基于R 软件的EmpowerStates （易侕统计软件：www.empowerstats.com）进行统计分析。连续变量以平均数±标准差(±s )表示，组间比较采用t 检验；分类变量以率（%）表示，采用卡方检验分析；采用多元回归分析探讨不同源性精子ICSI 后临床结局及围产期结局有无统计学差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、两组患者一般资料比较

两组患者的平均女方年龄、平均男方年龄、平均不孕年限及不孕因素构成比有统计学差异，P＜0.05。手术取精组夫妻双方年龄相比对照组年轻，不孕年限较短，同时合并女方不孕因素所占比例较低。

表1 两组患者一般资料比较[(±s),n(%)]

表1 两组患者一般资料比较[(±s),n(%)]

手术组(n=230) 对照组(n=1018) P女方年龄 27.78±2.94 28.94±3.05 ＜0.001男方年龄 29.68±4.49 31.24±4.76 ＜0.001不孕年限 3.51±2.26 4.07±2.61 ＜0.05不孕因素 ＜0.001单纯男性因素 213(92.61) 713(70.04)合并女方因素 17(7.39) 305(29.96)

二、两组患者促排卵实验室指标比较

与对照组相比，手术取精组患者平均Gn 用量少，HCG日E2 水平较高，移植日内膜厚度较厚，移植日内膜形态相对好，均有统计学差异（P＜0.05）；手术取精组患者平均获卵数及MⅡ卵数相对较多，但是ICSI 后的受精率及正常受精率相对低于对照组，P 均＜0.05；手术取精组的平均可利用胚胎数略高于对照组，有统计学差异（P＜0.05）。两组患者HCG日P 水平、平均移植胚胎个数及卵裂期胚胎移植所占比例无统计学差异（P＞0.05）。

三、两组患者的妊娠结局及围产期结局比较

手术取精组平均临床妊娠率高于对照组，有统计学差异（P＜0.05）；但是两组间的多胎率、早期流产率、胎儿畸形引产率、活产率、剖宫产率、＜37 周早产率及双胎活产构成比均无统计学差异（P＞0.05），单胎活产或双胎活产的子代出生孕周和出生体重均无统计学差异（P＞0.05）。两组均无畸形儿出生。

表2 两组患者的促排卵实验室指标比较[(±s),n(%)]

表2 两组患者的促排卵实验室指标比较[(±s),n(%)]

注：E2 和P 法定单位分别为pmol/L 和nmol/L，换算公式分别是(pg/ml)×3.66 和(ng/ml)×3.17

手术组(n=230） 对照组(n=1018） p 值Gn 总量（支） 25.11±11.83 28.06±13.70 ＜0.05 Gn 总天数 10.83±1.83 11.07±2.01 ＞0.05 HCG日E2 值(pg/ml) 3603.94±1178.283276.30±1209.58 ＜0.001 HCG日P 值(ng/ml) 0.94±0.35 1.01±1.51 ＞0.05移植日内膜厚度（cm） 1.07±0.15 1.05±0.14 ＜0.05移植日子宫内膜形态百分比 ＜0.05 B 型 25(10.87) 65(6.39)B-C 型 196(85.22) 922(90.57)C 型 9(3.91) 31(3.04)移植胚胎胎龄百分比 ＞0.05卵裂期胚胎 225(97.83) 996(97.84)囊胚 5(2.17) 22(2.16)平均移植胚胎数 1.93±0.28 1.95±0.30 ＞0.05获卵数 12.62±4.19 11.74±4.03 ＜0.05 MⅡ卵数 10.70±4.17 9.79±3.83 ＜0.001受精率 77.02 79.28 ＜0.05正常受精率 72.16 74.56 ＜0.05卵裂率 97.55 97.03 ＞0.05可利用胚胎数 5.53±3.12 5.07±2.95 ＜0.05优良胚胎数 3.65±2.66 3.45±2.48 ＞0.05

表3 两组患者的妊娠结局及围产期结局比较[(±s),n(%)]

手术组(n=230) 对照组(n=1018) P临床妊娠率 150/230(65.22) 589/1018(57.86) ＜0.05多胎率 65/150(43.33) 217/589(36.84) ＞0.05早期流产率 10/150(6.67) 53/589(9.00) ＞0.05胎儿畸形引产率 1/150(0.67) 1/589(0.17) ＞0.05活产率 129/230(56.09) 487/1018(47.84) ＞0.05剖宫产率 92/129(71.32) 370/487(76.76) ＞0.05＜37 周早产率 29/129(22.48) 90/487(18.48) ＞0.05单活胎 ＞0.05比例 83/129(64.34) 321/487(65.91) ＞0.05出生孕周(w) 38.84±1.26 38.81±1.68 ＞0.05出生体重(g) 3261.07±459.253303.60±503.70 ＞0.05双活胎 ＞0.05比例 46/129(35.66) 166/487(34.09) ＞0.05出生孕周(w) 36.12±1.79 36.49±1.77 ＞0.05小孩1 出生体重(g) 2485.70±472.102575.91±417.33 ＞0.05小孩2 出生体重(g) 2402.72±347.282486.30±408.89 ＞0.05

四、多元回归分析

鉴于上述基线资料不平，进一步行多元回归分析，在调整了夫妻双方年龄、 不孕年限、 不孕因素、Gn 总量、HCG日E2、HCG日P、获卵数、MⅡ卵子数、移植日子宫内膜厚度及子宫内膜形态等混杂因素后，提示手术取精组临床妊娠率高于对照组（P＜0.05），两组的子代出生体重和出生孕周并无差别。

表4 多元回归分析[OR(95%CI)/β(95%CI)]

讨 论

卵 胞 浆 内 单 精 子 注 射（ICSI，intra-cytoplasmic sperm injection） 技术是指实验室胚胎学家利用显微操作系统，根据精子形态学和动力学标准，将经过优选后的单个精子直接注射到卵子细胞内的被动受精过程。相对于“一代试管婴儿”技术，ICSI 技术是针对男性不育的治疗手段。关于ICSI 技术的安全性问题，近些年来研究[2]认为并没有证据提示ICSI 技术本身引起胎儿畸形，与常规IVF 相比，ICSI 并不增加子代出生缺陷的发生风险。尽管如此，国内邵小光学者[3]提出，ICSI 逃避了自然选择可能带来风险，建议应严格限制非男性不育因素ICSI 在临床的扩大性应用。

临床上经过连续2 次以上精液常规离心沉淀后未见精子称为无精症，占男性不育患者的10%～15%，根据输精管道是否梗阻，分为梗阻性无精症和非梗阻性无精症[4,5]。随着附睾/睾丸穿刺取精术及睾丸显微取精术的发展[6,7]，梗阻性无精症患者及部分非梗阻性无精症患者可以通过手术取精后ICSI 助孕技术生育与自己有血缘关系的子代。

国内研究[7-12]报道射出精子、睾丸精子及附睾精子做ICSI 后临床妊娠率、 活产率及流产率并无统计学差异。本研究回顾性分析1248 个鲜胚移植的ICSI 治疗周期的一般指标、促排卵实验室指标、临床结局及围产期结局指标，结果提示：手术取精组在获卵数和MⅡ卵数更多的情况下，受精率和正常受精率显著低于对照组（P＜0.05）；手术取精组的活产率、流产率、＜37 周早产率及子代出生孕周和出生体重两组均无差异； 两组均无出生缺陷的发生。国内研究[13]曾指出不同源性精子的成熟度可能主要影响ICSI 受精率，与本研究结论相一致，即手术取出的睾丸/ 附睾精子的ICSI 受精率显著低于射出精子的ICSI 受精率。

同时，由于两组患者年龄等基线资料不平衡，故通过多元回归分析方法，在调整了两组间不平衡基线资料后，提示附睾/睾丸精子经ICSI-ET 术后临床妊娠率高于射出精子，差异有统计学意义。同时本研究的数据提示手术取精组与对照组相比，流产率有降低趋势，活产率有升高趋势，虽然无统计学差异。关于这点目前研究结论尚存在一定的争议。有很多学者的研究报道[7-12]认为不同源性精子ICSI 后的临床妊娠率、 流产率及活产率无差别。然而近些年来，越来越多的证据表明，用睾丸精子代替射精精子的ICSI（当两者都可用时）在某些特定情况下会增加妊娠结局[14-16]。有研究[14]提示非无精子症男性的睾丸精子的DNA 碎片率比射出精子DNA 碎片率低2-3 倍。2017年Meta 分析[17]提示睾丸精子组经ICSI 治疗后的临床妊娠率和活产率显著高于射出精子组，流产率显著低于射出精子组。对于严重少弱精及隐匿性精子症的男性患者，睾丸精子经ICSI-ET 助孕后临床结局更优的原因可能在于睾丸精子的DNA碎片率明显低于射出精子的DNA 碎片率[14]。

因本研究是回顾性分析，仍存在有不足之处。两组间样本量差距较大，可能影响临床妊娠率的变量纳入不全，可能对统计结果有一定的影响，以后尚需进一步积累手术取精组的样本量，扩大样本量及增加纳入变量后进一步验证。