利用实时剪切波超声弹性成像定量评价阴茎平滑肌含量变化的实验研究*

邢晋放

复旦大学附属浦东医院/上海市浦东医院超声医学科（上海 201399）

阴茎海绵体是调控勃起功能的重要组织，在海绵体中，平滑肌组织约占40%-52%[1]，平滑肌的功能是完成阴茎的舒张及勃起，因此，平滑肌的含量对勃起功能产生直接影响，定量评价阴茎组织平滑肌的含量具有重要意义。目前，定量评价阴茎组织平滑肌含量必须采用有创的组织活检技术，由于阴茎器官的特殊性，有创方法的临床应用十分受限。

实时剪切波弹性成像 (shear wave elastrography,SWE)是一项无创的新型超声定量检查技术，该技术成像原理不同于常规灰阶超声 （brightness mode ultrasonography,B 型超声），B 型超声主要从形态学方面观察病变，SWE 基本原理是利用探头发射声辐射力脉冲，进入组织导致组织粒子振动并产生横向剪切波，成像系统可以精确检测出感兴趣区组织中横向剪切波的速度（shear wave velocity,SWV）并进行实时成像和推算出被测组织的弹性量化测值（shear wave elastic quantitative measurement,SWQ）[2-4]。组织的细胞种类及含量可以直接影响SWV，从理论上讲，SWQ 可以反映出被测组织细胞种类及含量的改变； 同时，初步研究发现，SWE 技术在阴茎疾病诊断方面具有价值[5-8]。据此，本研究试图利用SWE 技术检测平滑肌细胞含量不同的大鼠阴茎组织，探讨SWQ 是否可以定量评价平滑肌含量的变化。

材料与方法

一、动物及试剂

（一）动物

20 只健康雄性SD 大鼠分成低年龄组（5-6 周龄，10 只）和高年龄组（52-60 周龄，10 只），20 只大鼠饲养环境完全相同。

（二）试剂

兔抗大鼠α-actin 抗体(ab82247,abcam)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗体(ab6734,abcam)。

二、实验方法

（一）SWE 检查

1、SWE 成像

采用5%水合氯醛（剂量0.6 ml/100 g）进行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后取仰卧位，固定四肢，充分暴露阴茎后开始进行SWE 成像，仪器采用AixplorerR新声威超声诊断仪 （SuperSonic Imagine,France），探头为SL 15-4，取阴茎横切面进行扫查，B 型超声清晰显示阴茎组织后启动SWE，图像优化选择“Pen”，SWE 成像框应大于阴茎横切面。分别选取阴茎近阴茎头部、中部及近根部进行SWE 成像并实时存图。

2、SWQ 测量

选取质量合格的SWE 图像进行SWQ 测量，质量合格SWE 图像的标准是： 感兴趣区内色彩充填完整、呈油画样充填，无马赛克样彩色斑点。测量感兴趣区（圆形）的划定标准为以包膜为外界最大范围地包绕阴茎，分别对阴茎头部、中部及根部进行SWQ 测量，单位为kPa。

（二）阴茎平滑肌含量分析

1、取材

大鼠麻醉后，从阴茎根部用组织剪迅速剪断，置入4%多聚甲醛固定液中，固定12～24 小时。

2、组织脱水

将阴茎从固定液中取出后擦干，依次置入70%、80%，90%、95%酒精中各2 小时，再置入100%酒精I和Ⅱ中各1 小时。

3、透明、包埋及切片

将脱完水的阴茎组织置入二甲苯中透明，透明时间根据组织的透明程度而定，大约是30 min。透明完毕后置入浸蜡，温箱中过夜，次日进行包埋。修好蜡块后，将阴茎组织按照阴茎头部、中部及根部进行切片，切片厚度为5 μm，用涂抹了自制防脱液的载玻片捞取已展平的组织切片。

4、免疫组化染色

切片脱蜡至水，热抗原修复10 min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗5min×3 次，擦干；滴 加3%H2O2，PBS 冲 洗5min×3 次，滴 加 封 闭 血 清15min，甩干；滴加兔抗大鼠α-actin 抗体(1：50)，室温孵育4 h，PBS 冲洗5min×3 次；滴加山羊抗兔二抗15 min，PBS 冲洗5min×3 次，擦干； 滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色，显微镜下控制显色时间，蒸馏水冲洗中止显色；苏木素复染，脱水至二甲苯，树胶封片。

5、图像的采集和分析

免疫组化染色的图像分析利用彩色图文分析系统，由从事病理专业大于5年的医师进行图像分析及数据测量，分别测量阴茎头部、中部及近根部组织切片中α-actin 阳性区域百分比 （positive area percentage,PAP）,PAP 代表平滑肌细胞的含量。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0 分析软件进行统计分析，数据均以均数±标准差表示。采用单样本K-S 检验验证两组大鼠的SWQ、PAP 是否符合正态分布，利用Levene 方差齐性检验分析两组大鼠的SWQ 和PAP 方差是否相等。如果数据符合正态分布且方差齐，则使用两独立样本t检验分析两组大鼠SWQ 之间的差异和PAP 之间的差异，如果样本不符合正态分布或方差不齐，则使用Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

结 果

一、SWE 检查

所有大鼠均成功完成阴茎组织的SWE 成像及SWQ 测量（图1），灰阶超声图像显示阴茎横切面呈圆形，边界清晰，包膜完整，内部为均匀低回声，SWE 图像显示阴茎组织内色彩充填完整、呈油画样，无马赛克样斑点。

低年龄组及高年龄组大鼠阴茎组织SWQ 均符合正态分布（P=0.200），但两组方差不齐（P=0.011）。低年龄组大鼠阴茎组织SWQ 为（9.75±1.06）kPa，高年龄组大鼠阴茎组织SWQ 为（8.45±1.85）kPa，高年龄组大鼠阴茎组织SWQ 明显低于低年龄组（P=0.001）。

图1 大鼠阴茎SWE 图像

二、平滑肌细胞含量

图2 显示两组大鼠阴茎组织α-actin 的表达情况，低年龄组大鼠平滑肌稀疏，染色浅淡，高年龄组大鼠平滑肌则较为密集，着色较深。

低年龄组阴茎组织PAP 符合正态分布（P=0.200），高年龄组阴茎组织PAP 不符合正态分布（P=0.035），两组方差不齐（P<0.001）。低年龄组大鼠阴茎组织PAP 为（3.56±0.92）%，高年龄组大鼠阴茎组织PAP 为（17.54±8.24）%，高年龄组大鼠阴茎组织PAP 明显高于低年龄组（P<0.001）。

图2 两组大鼠阴茎组织α-actin 表达情况

讨 论

阴茎海绵体主要有两种细胞构成，即平滑肌细胞和成纤维细胞；其中平滑肌细胞约占40-52%[1]，是海绵体舒张的结构基础，胶原纤维细胞构成海绵体的纤维支架结构，维持海绵体硬度，防止阴茎变形、弯曲[9]。迄今为止，国内外学者普遍认为，阴茎勃起的基本机制是：在性刺激下，平滑肌舒张，海绵体组织充血肿胀，海绵体内压逐渐升高，同时白膜下静脉受压，回流血量逐渐减少，当海绵体内压足够大时，阴茎动脉血流流入停止，阴茎白膜下静脉受压而没有血流流出，阴茎处于一个完全闭合的状态，达到完全勃起。因此，平滑肌的含量直接影响勃起功能，准确评价阴茎组织内平滑肌细胞的含量至关重要。

目前，临床准确评价阴茎组织平滑肌含量的唯一方法是活检获取阴茎组织样本并通过免疫组化染色进行细胞定量，免疫组化染色进行阴茎组织平滑肌细胞含量的定量分析机制如下： 阴茎组织中平滑肌主要有海绵体平滑肌细胞和血管平滑肌细胞两种类型，以海绵体平滑肌细胞为主，海绵体平滑肌细胞具有收缩功能，含有α-actin，α-actin 抗体可以作为定量海绵体平滑肌细胞的标记物。该方法取材操作时技术要求高，且为有创检查，术后易造成阴茎疼痛、阴茎硬结等副作用，患者难以接受，实际临床应用受到了极大限制，探索一种无创评价活体阴茎组织平滑肌细胞含量的方法具有重要的临床意义。

目前，超声影像是阴茎组织首选的临床影像学检查方法，但是，常规超声检查（灰阶和多普勒）尚不能评价阴茎组织平滑肌细胞的含量。SWE 是一项无创的新型超声定量检查技术，该技术成像原理与常规B 型超声不同：B 型超声主要获取和显示病变的形态学信息和特征，SWE 基本原理是利用探头发射声辐射力脉冲，在组织不同深度上连续聚焦，被聚焦部位组织粒子高效振动并产生横向剪切波，成像系统可以精确检测出感兴趣区组织中各个质点的横向剪切波的速度（SWV）并进行实时成像和推算出感兴趣区组织的弹性量化测值（SWQ）。由于感兴趣区组织中细胞种类及含量直接影响SWV，因此从理论上讲，SWQ 测值可以反映出被测组织的细胞种类及含量的改变。近几年，国内外学者开展SWE 技术的相关研究，初步发现，SWE 技术在诊断阴茎硬结症、勃起功能障碍方面具有独特的价值[5-8]。据此，作者希望通过本研究证实：利用SWE 技术可以定量评价阴茎组织平滑肌含量的改变。

阴茎组织平滑肌的含量与年龄密切相关，正常生理条件下，不同年龄阶段的阴茎组织平滑肌含量不同，故我们选取不同年龄组的大鼠进行研究。本研究选取α-actin 抗体进行阴茎组织的免疫组化染色分析，定量测定阴茎组织平滑肌含量，并以此作为“金标准”；同时,利用SWE 观测大鼠阴茎组织的SWQ，结果显示：低年龄组和高年龄组大鼠阴茎组织平滑肌含量存在显著差异，两组大鼠阴茎组织的SWQ 也存在显著性差异。这一研究结果提示：SWQ 可以作为一项定量分析阴茎组织平滑肌含量的新指标，SWE 有望成为一种评价阴茎组织平滑肌含量的无创新方法，值得进一步研究。