IGF-1 受体和雌激素受体在胚胎移植失败患者子宫内膜中的表达及其与子宫内膜容受性的关系

刘艳君 卜晓萌 张巧利 褚春芳 马延敏 王 雪

子宫内膜容受性降低是临床胚胎移植反复失败的主要原因之一[1]。胞突饮是子宫内膜容受性的辅助评估指标之一，然而目前还不能准确检测胞突饮发育情况，因此寻找可靠的生物标志物来评估子宫内膜容受性，可能对降低胚胎移植失败率有重要意义[2-3]。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)及其受体(IGF-1R)分布于人体各组织，对胚胎早期种植及滋养层细胞的侵入和迁移有促进作用[4]。雌激素(estrogen，E)是一类含18个碳原子的类固醇激素，对乳腺细胞分化、乳腺导管上皮增生及泌乳均有重要作用[5]。目前国内外对IGF-1R、雌激素受体(estrogenreceptor，ER)与妊娠高血压、糖尿病及妊娠期子宫肌瘤之间关系的研究较多[6-7]，然而IGF-1R、ER在反复胚胎移植失败患者子宫内膜中的表达及其与子宫内膜容受性关系的研究仍较少。本研究通过检测反复胚胎移植失败患者及首次冷冻胚胎移植获得临床妊娠的患者子宫内膜中IGF-1R、ER mRNA水平及其与子宫内膜容受性的关系，以期为探索子宫内膜容受性预测指标开辟新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年9月至2018年7月首都医科大学附属北京妇产医院生殖中心就诊的胚胎移植3次均失败的86例患者为研究对象(观察组)；同时期选取首次冷冻胚胎移植获得临床妊娠的73例患者作为对照组。两组年龄、体质指数(body mass index，BMI)、不孕年限等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。纳入标准：①3次及以上胚胎移植均失败者[胚胎移植15 d测血人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)≥50 IU/L为生化妊娠，否则均视为胚胎移植均失败]；②资料齐全者；③B超显示子宫形态正常者；④基础内分泌正常、月经规律者；⑤卵泡晚期内膜三线征明显，厚度≥8 mm者。排除标准：①3个月内宫腔操作及激素治疗者；②子宫内膜异位症、子宫肌瘤、多囊卵巢综合征者；③伴高血压、先天性心脏病等心血管疾病者；④伴有糖尿病等内分泌疾病者。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法 查阅门诊病历，收集患者入院前一般资料，包括年龄、BMI、不孕年限、不孕原因、不孕类型等，所有患者均由2名及以上主治医师明确诊断。采用qRT-PCR法检测患者子宫内膜中IGF-1R、ER mRNA表达水平；通过扫描电镜检测子宫内膜胞饮突发育情况；采用Pearson法分析患者子宫内膜IGF-1R、ER水平与发育完全胞饮突数量的相关性。

1.2.1 子宫内膜标本采集及保存 所有研究对象均于种植窗期(排卵第6～8天)取少许子宫内膜标本，若经B超检测卵泡发育情况发现不排卵，则放弃本周期检查。采用直径0.3 cm的子宫内膜取样器采集中段标本，立即用生理盐水洗去血污，干纱布吸去水分，迅速置于-20℃保存待测。

1.2.2 控制性超促排卵及胚胎移植方案 所有研究对象均于体外受精/卵泡浆内单精子注射受精-胚胎移植。于控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)周期的月经第1～3天起每日肌注促性腺激素(gonadotropin，Gn)(齐一生物科技；批号：4778-1000，1 mg)并进行B超检测卵泡发育。当有2～3个卵泡直径大于18 mm时，停用Gn，肌肉注射hCG(上海雅吉，批号：41115P，100 μL)10 000 IU，36 h后取卵并受精。在取卵后第3～6天选择优质胚胎进行冷冻玻璃化保存。采用自然周期法准备子宫内膜，参考之前月经周期规律，于月经结束第8～12天进行阴超检查，监测卵泡发育及子宫内膜生长情况。在优势卵泡直径≥14 mm时检测尿促黄体生成素(lutein hormone，LH)；在卵泡直径≥18 mm时，检查患者LH、雌激素(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)。采用快速复温法复苏胚胎，孵育2 h后选择2枚优势胚胎进行移植。

1.2.3 qRT-PCR法检测子宫内膜IGF-1R、ER mRNA水平 采用上海名劲生物科技有限公司生产的Trizol RNA提取试剂盒(货号：5003050)提取子宫内膜总RNA，反转录得cDNA，操作严格按照试剂盒说明书进行。采用广州市百菱生物科技有限公司生产的ABI 7500实时荧光定量PCR仪对IGF-1R、ER进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1μL，德国QIAGEN公司生产的miScript SYBR©Green Mix(货号：218076)5 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，双蒸水 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反应条件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、1 min，40个循环；72℃，10 min。IGF-1R、ER及内参GAPDH的引物序列见表2。每份样品均设3个重复孔，采用2-ΔΔCT法对子宫内膜IGF-1R、ER mRNA含量进行定量分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.4 子宫内膜胞饮突发育检测 采用扫描电镜观察子宫内膜胞饮突发育状况，记录3个内膜面的胞饮突数目的平均值，发育程度判断标准与Mirkin等[8]报道标准一致(若在同一子宫内膜样本中观察到不同发育阶段的胞饮突，仅记录其最普遍存在的表达方式)。膜状突起开始形成，并发展到整个细胞顶部，微绒毛变短、变少、相互融合，即为发育中的胞饮突；微绒毛完全消失、膜状突起变大，高于纤毛细胞，形状如蘑菇，即为完全发育的胞饮突；胞饮突开始萎缩，微绒毛重新出现，细胞体积变大，即为退化中的胞饮突。

1.3 观察指标 ①比较两组控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)及移植情况；②比较两组子宫内膜IGF-1R、ER mRNA水平；③比较两组子宫内膜胞饮突发育情况；④分析IGF-1R、ER与发育完全胞饮突数量的相关性。

2 结果

2.1 两组COH及移植情况比较 两组Gn用量、Gn使用天数、基础卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、获卵数、移植日内膜厚度、移植胚胎数目、移植优质胚胎数目、受精率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组COH及移植情况比较

2.2 两组子宫内膜IGF-1R、ER mRNA水平比较 观察组子宫内膜IGF-1R、ER mRNA水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组子宫内膜IGF-1R、ER mRNA水平比较

2.3 两组子宫内膜胞饮突发育情况比较 对照组子宫内膜胞饮突发育完全例数较多，观察组胞饮突发育中/退化例数较多，两组差异有统计学意义(P<0.05)。观察组子宫内膜胞饮突完全发育数目低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

2.4 IGF-1R、ER与发育完全胞饮突数量的相关性 IGF-1R、ER水平与完全发育胞饮突数量均呈正相关(r=0.699、0.650，P均<0.05)。见图1、2。

表5 两组子宫内膜胞饮突发育情况比较

图1 IGF-1R与发育完全胞饮突数量的相关性

图2 ER与发育完全胞饮突数量的相关性

3 讨论

随着辅助生殖技术发展及胚胎移植技术日益成熟，不孕患者妊娠率大幅提高，但仍有许多患者胚胎移植反复失败，其主要原因是子宫内膜容受性较差促使胚胎着床成功率降低[9-10]。目前用于预测子宫内膜容受性的标志物及方法主要有胞饮突、蛋白组学、子宫内膜容受性芯片，为探索生化标志物用于预测子宫内膜容受性提供了有利条件[11]。本研究探究子宫内膜IGF-1R、ER水平与其容受性的关系，为IGF-1R、ER作为预测子宫内膜容受性的生化标志物提供了基础。

IGF-1与其受体IGF-1R特异性结合后能激活胰岛素受体底物蛋白通路，促进细胞迁移和增生。IGF-1R能作用于卵母细胞，促进卵母细胞的成熟。IGF-1R水平影响子宫内膜的增殖和发育，可能进一步影响子宫内膜容受性和胚胎着床的成功与否[12-13]。ER在子宫内膜的间质及腺体广泛分布且呈周期性表达，除调节雌激素水平外还能控制子宫内膜的生长，控制子宫内膜对激素的应答[14]。ER可通过解除对某些基因的抑制，在种植窗期起到降调解作用，从而在子宫内膜容受性的形成中发挥重要作用[15]。

本研究结果显示，观察组子宫内膜中IGF-1R、ER水平低于对照组，且与发育完全胞饮突的数量均呈正相关，与王巧凤等[16]研究结果相似。提示胚胎移植失败患者子宫内膜中IGF-1R、ER水平均低于首次胚胎移植妊娠成功人群，推测可能原因是IGF-1R、ER通过降低表达水平，调节雌激素的水平，抑制卵母细胞的成熟及子宫内膜的发育，影响子宫内膜的容受性，进一步降低胚胎着床的成功率，使得妊娠失败。两者水平与胞饮突呈明显相关性进一步提示，IGF-1R、ER水平与子宫内膜容受性有密切联系。胡秋兰等[17]在研究针灸改善子宫内膜容受性的进展中表明，可通过针灸提高ER水平，从而改善胚胎移植反复失败患者子宫内膜的容受性，提示ER与子宫内膜容受性有密切联系，与本研究结论基本一致。本研究中，两组年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、助孕方式、Gn用量、Gn使用天数、基础FSH、获卵数、移植日内膜厚度、移植胚胎数目、移植优质胚胎数目、受精率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示基础因素对妊娠成功与否影响较小。

综上所述，IGF-1R、ER水平能作为预测子宫内膜容受性的参考指标，临床可通过密切监测其水平，采取合理措施改善妊娠结局。但本研究受样本量、地域、实验条件等因素影响，目前只能将两者水平作为参考指标，不能进行临床应用，需加大样本量对其临床应用价值及具体作用机制进一步深入研究。