Rett综合征致病基因突变与临床表型的研究

杨 李 王宝田 唐久来 吴 德

Rett综合征是一种主要累及女性患儿，严重影响运动及智力发育的遗传性罕见病，女童患病率为1/15 000～1/10 000，男性患儿更为罕见，约95%的患儿由位于X染色体长臂上的甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MECP2)基因突变所导致，其他如细胞周期蛋白依赖激酶5(cyclin-dependent kinase like 5，CDKL5)、叉头盒蛋白G1(forkhead box protein G1，FOXG1)等基因突变也可导致本病的发生[1]。典型Rett综合征经过早期的正常发育至6～18个月龄后，出现已获得技能的迅速退化、典型手部运动、小头畸形、自闭症、共济失调以及呼吸节律紊乱等；除了典型Rett综合征外，还有非典型的变异型，如先天性变异型、恢复部分言语能力的语言保留型及早发癫痫型[1-2]。本研究总结Rett综合征临床表现、分析突变基因，扩展临床表型，提高对本病的早期诊断。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取2017年1月至2019年12月在安徽医科大学第一附属医院儿科就诊，明确诊断为Rett综合征的患儿，收集临床资料，病例采集前患儿监护人均已签署知情同意书。

病例1：女性，诊断年龄3岁7个月，系第1胎第1产，患儿1岁余可独走，但仅能无意识发“ba、ma”音，曾以“孤独症”外院治疗，约2岁半时出现显著倒退，表现为独走不稳，出现双手反复交替用手指触碰舌头后放下的手部刻板动作，不再主动抓物，仅会发“a”音，不与人交流。3岁6个月出现癫痫，全面性强直发作，现接受抗癫痫药物与生酮饮食治疗。父母表型正常，否认家族史。

病例2：女性，诊断年龄1岁3个月，系第2胎第2产， 6～13个月期间身高增长缓慢，仅2 cm，现不会爬行，可扶站，无意识发“ba、ma”音，手部精细动作差，伴有刻板动作搓手、磨牙，头围43 cm，睡眠质量较差、节律紊乱，易激惹。患儿姐姐2岁8个月表型正常，父母表型正常，否认家族史。

病例3：女性，诊断年龄2岁，系第1胎第1产，6月龄前发育基本正常，1岁2个月时家长发现患儿只会无意识发“yi、ya”音，双手出现无法稳定抓握，1岁5个月出现手部刻板动作，喜搓手、用手拍头，与人交流欠佳，现患儿2岁，偶喜尖叫，与人无眼神交流，多动，手部刻板动作无改善，独走欠稳。父母表型正常，否认家族史。

病例4：女性，诊断年龄4岁，系第2胎第1产，发育里程碑稍落后，2岁余可独走，但姿势异常，可有意识发“ye、ma”音，其后逐渐出现运动认知倒退，手拍口唇、搓手等刻板动作，眼神呆滞，情绪易激动，4岁时癫痫频发，为全面性强直阵挛发作和复杂部分性发作。我院检查示：高磷血症、肾源性血尿；现接受抗癫痫药物及生酮饮食治疗。父母表型正常，否认家族史。

病例5：男性，诊断年龄3岁1个月，系第1胎第1产，10月龄独坐不稳，无意识发“ba、ma”音，伴有通贯手，曾间断随访于我科，1岁7个月获独坐能力，3岁1个月时已无法独坐，不会发“ba、ma”音，四肢肌力、肌张力低下，出现脊柱侧弯，睡眠节律紊乱，喜磨牙。患儿母亲智力低下，无法生活自理，父亲边缘智力，基本生活与体力劳动无障碍。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集患儿及父母全血2 mL，提取DNA并质检，合格后进入分析步骤。

1.2.2 测序与生物信息学分析 构建全外显子文库，通过illumina公司NovaSeq 6000系列测序仪进行高通量测序(PE150)，测序覆盖度不低于99%。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)等软件筛选及过滤，获得可靠高质量突变数据。对检测到的突变数据进行各大数据库，如单核苷酸多态性数据库(the Single Nucleotide Polymorphism Database，dbSNP)、千人基因组(1000 Genomes Project)、外显子组整合数据库(the exome aggregation consortium,ExAC)、外显子测序计划(Exome Sequencing Project,ESP)等频率数据库，在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database,HGMD)、临床相关的序列变异(Clinically Relevant Sequence Variations, ClinVar)等的关联注释。借助Provean、Polyphen2-HVAR、SIFT、Revel、M-Cap等蛋白结构预测软件进行危害性分析，筛选可能影响蛋白结构的有害变异。

1.2.3 Sanger法一代测序验证 根据需要验证的位点进行引物设计，PCR技术扩增，对患儿及其父母样本测序验证。

1.2.4 危害性评级 根据注释信息、频率数据库等依据美国遗传学会(American College of Medical Genetics,ACMG)2015诊断指南，综合评定危害等级为5级：致病、可能致病、良性、可能良性及意义未明。

2 结果

2.1 临床特点 病例1～4均符合典型Rett综合征的临床诊断标准，病例5符合非典型Rett综合征临床诊断标准[2]，见表1。病例1除了典型Rett综合征的表现外，同时伴发有癫痫；病例2头围43 cm，低于正常同龄儿童2个标准差；病例4伴有癫痫、碱性磷酸酶升高、高磷血症、肾源性血尿；病例5为男性患儿，虽然该病例1岁2个月即明确存在致病突变，但至3岁后症状趋于明显。

续表1

2.2 分子遗传学检测结果

病例1：检测到一个位于X染色体的杂合基因突变 MECP2[c.808(exon4)C>T，p.Arg270Stop，217]，即第808号核苷酸由C突变为T，导致翻译产物的第270号的精氨酸以后的217个氨基酸无法翻译。Clinvar数据库和HGMD数据库中已确定相同的致病变异或者有相同的氨基酸改变。患儿父母上述位点均未检测到变异，故属新生变异，综合评定危害等级：致病。Sanger测序验证见图1-A。

病例2：检测到一个位于X染色体的杂合基因突变MECP2[c.763(exon4)C>T，p.Arg255Stop，232]，即第763号核苷酸由C突变为T，导致翻译产物的第255号的精氨酸以后的232个氨基酸无法翻译。Clinvar数据库和HGMD数据库中已确定相同的致病变异或者有相同的氨基酸改变。患儿父母上述位点均未检测到变异，故属新生变异，综合评定危害等级：致病。Sanger测序验证见图1-B。

病例3：检测到一个位于X染色体的杂合基因突变MECP2[c.799(exon3)C>T，p.Arg267Stop，220]，即第763号核苷酸由C突变为T，导致翻译产物第267号的精氨酸以后的220个氨基酸无法翻译。Clinvar数据库和HGMD数据库中已确定相同的致病变异或者有相同的氨基酸改变，PubMed查询到该变异致病性的文献报道。患儿父母上述位点均未检测到变异，故属新生变异，综合评定危害等级：致病。Sanger测序验证见图1-C。

病例4：检测到一个位于X染色体的杂合基因突变MECP2[c.916(exon4)C>T，p.Arg306Cys]，即第916号核苷酸由C突变为T，导致翻译产物第306号氨基酸的精氨酸翻译成半胱氨酸。Clinvar数据库和HGMD数据库中已确定相同的致病变异或者有相同的氨基酸改变。患儿父母上述位点均未检测到变异，故属新生变异，综合评定危害等级：致病。Sanger测序验证见图1-D。

图1 突变Sanger测序验证结果

病例5：检测到一个位于X染色体的半合子基因突变MECP2[c.1148(exon4)_c.1198(exon4)del，insC，p.Leu383Profs*5]从编码序列1 148位置到1 198位置缺失50个碱基，导致其翻译产物从第383位异亮氨酸开始，再翻译5个氨基酸后终止；经蛋白结构预测软件(Provean、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster)2种以上统计方法预测该变异对基因及产物有影响。在正常人数据库(dbSNP、千人南方、千人基因、ExAC等)中未见收录，OMIM、HGMD、Clinvar数据库中未发现疾病相关性报道。患儿父亲为野生型，母亲为杂合，故该患儿致病突变来源于其母亲，综合评定危害等级：致病。Sanger测序验证见图2。

图2 突变Sanger测序验证结果

3 讨论

Rett综合征是一种以运动、语言发育退化，以及典型的手部刻板动作等为特征的遗传性疾病，上世纪60年代奥地利医生Rett首次报道[3]。Rett综合征患儿早期生长发育史大致正常，但随后出现非连续性的病程进展，包括：停滞期、快速退化期、平台期及后期运动退化期4个阶段。在快速退化期，患儿会部分或者全部丧失有目的的手部功能和语言能力，同时出现运动障碍、呼吸异常，自闭特征逐渐显现，以及癫痫发作等[2,4]。

Rett综合征公认并且最新的诊断标准是(国际)Rett研究联盟(Rett Search Consortium)于2002年诊断标准基础上2010年再行修订的版本，标准中指出：临床诊断典型Rett综合征需满足全部的主要标准和排除标准，虽然支持标准在典型Rett综合征中较为常见，但不是诊断的必要条件；而非典型Rett的诊断确立需至少满足2条主要标准，且同时达到5条支持标准。由于标准中所罗列的临床特征多具有年龄依赖性，即临床表现到一定年龄阶段才会显现出来[2]，低年龄儿童的诊断的难度要大于年长儿。因此，在实际临床工作中基因学检测有助早期诊断，本研究病例2、病例5是基于基因学的早期诊断，其中病例5早期诊断 “可能非典型Rett综合征”，后期随访中其临床症状趋于明显，诊断为“不典型Rett综合征”。

癫痫虽未列于诊断标准中，却是Rett综合征常见的临床表型。60%～80%的Rett综合征患儿合并癫痫，在非典型Rett综合征和严重表型的Rett综合征患儿中发病率更高，常见的发作类型为复杂部分性以及全面性强直发作[5]。本研究中，病例1为全面性强直发作，病例4为复杂部分性以及全面性强直-阵挛发作。需要指出的是，Rett综合征的呼吸节律紊乱可导致呼吸暂停、发绀、凝视，以及肌张力障碍等类似癫痫症状。本研究病例4同时伴有碱性磷酸酶升高、高磷血症、肾源性血尿，但该患儿未见有其他未明意义突变关联表型，且既往文献中未见描述，本研究为首次报道该表型。

Rett综合征绝大多数是由位于X染色体长臂上MECP2基因突变所致，约5%的患儿携带突变基因CDLK5、FOXG1或癫痫或智力障碍相关的突变基因。本研究中病例均为MECP2基因突变所致，其中病例1、2、3、4在Clinvar数据库和HGMD数据库中已确定相同的致病变异，或者有同样的氨基酸改变[6-7]；病例5为较为罕见的男性患儿，其突变遗传于有表型母亲，尚无相同突变的文献报道。国内报道1例MECP2基因突变致Rett综合征男童于18月龄时因“呼吸衰竭”死亡[8]。由于MECP2基因位于X染色体上，其突变被认为对发育中的男性胎儿及出生后男婴是致命的，故Rett综合征的男性数量较少，国内一项较大样本Rett综合征回顾性研究对象也均是女性患儿[7]。

MECP2编码甲基-CPG结合蛋白2，为核蛋白的一种，在每个组织细胞中均有表达，在神经元中尤其丰富，主要负责翻译后的修饰作用。MECP2作为一个转录调控因子特异性地与甲基化DNA结合，募集蛋白伴侣和调节复合物来修饰转录活性。MECP2有3个主要的功能域：甲基CpG结合域(methyl-CpG-binding domain，MBD)、转录抑制域(transcription repression domain,TRD)、C终端域( C-terminal domain,CTD)。本研究中，病例1、2、3、4突变位于TRD区域，可导致该区域蛋白结构的改变，影响与甲基化的 DNA结合，进而影响MECP2转录抑制功能；病例5的突变位于CTD区域，突变可所致的结构改变，影响介导染色质折叠能力(见图3)，参考文献[9]绘制。除了突变位点外，突变类型也是影响表型的重要因素，MECP2基因突变致所编码蛋白氨基酸截短突变的临床表型最为严重，而大多数的末端截短突变与错义突变的临床表型则较为温和[9]。本研究中，3例患儿为氨基酸的截短突变，1例移码突变，1例患儿为错义突变，但是错义突变病例4的表型仍较严重。由于Rett综合征杂合女性患儿是正常和突变MECP2的嵌合体携带者，因此临床表型的差异也与X染色体的差异性失活有关。同样，修饰基因的突变也可能减轻或增强患者的临床症状[10]，这可能是本例错义突变患儿表型仍较严重的原因。

图3 MECP2突变位点示意图

综上，Rett综合征是一种累及多器官系统的遗传性疾病，目前尚无特异性有效治疗手段，一些药物仍然处在临床前研究阶段[11]，需要个体化的综合康复治疗，其中生酮饮食对症状有改善作用，尤其是合并癫痫的Rett患儿[11-12]。结合其遗传学病因，目前有2种治疗研究思路，一种直接针对MECP2突变，对MECP2下游通路的靶点进行治疗；另一个潜在途径是基因疗法，即将正常的MECP2导入细胞进行治疗[4,9,13]。最近，一个靶向基因治疗罕见遗传性眼病Leber先天性黑矇在美国被批准应用，这可能也是未来治疗Rett综合征的重要方法[14]。