亚硒酸盐还原菌除硒效果与吸附机理分析

2020-07-17曾涛涛张诗琦付云书蔡萍莉荣丽杉

南华大学学报（自然科学版） 2020年3期

曾涛涛,张诗琦,胡青,付云书,蔡萍莉,荣丽杉

(南华大学污染控制与资源化技术湖南省高校重点实验室,湖南衡阳 421001)

0 引言

硒(Se)对人类健康有着极为重要的作用，但在采矿、金属冶炼、烧煤火电厂及局部农业灌溉中，产生的硒浓度稍高就会污染环境[1]，局部地方硒浓度甚至达到10 mg/L以上[2]。硒在自然界中主要以+6、+4、0和-2价四种价态存在[3]，其中Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)容易迁移扩散，引起硒污染[4]。国家对含硒废水处理日益重视，在2015年《城镇污水处理厂污染物排放标准》(征求意见稿)中，将总硒排放限值定为0.01 mg/L[5]。

传统物理、化学方法处理含硒废水包括：膜分离、混凝沉淀、吸附、电化学等[6]。这些方法存在成本高、能耗大，容易产生二次污染等问题。微生物可将高价硒还原成Se(0)，来降低硒污染风险，受到研究者重视。

研究发现芽孢杆菌、假单胞菌、肠杆菌、希瓦氏菌等[4,7]具有去除硒能力。李丹等[8]发现沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustrisstrain N)对2 mmol/L亚硒酸盐还原率达到91.4%。廖青等[9]从广西富硒区土壤中分离出8株硒能力较强的菌株，其在固体培养基中对硒的耐受浓度在10 000 μg/mL以上，分子生物学鉴定结果发现主要为芽孢杆菌与粘质沙雷氏菌。J.Zhang等[10]从安徽富硒土壤中分离到两株细菌，经过鉴定为Lysinibacillusxylanilyticus与Lysinibacillusmacrolides，它们在36 h内可完全去除1 mmol/L的亚硒酸钠。H.Ayano等[11]从土壤中分离得到一株Pseudomonassp.(假单胞菌)，能同时去除1 mmol/L的Se(Ⅳ)和Cd(Ⅱ)。

目前，已有分离的除硒菌主要从土壤中获得。为了研究水体中除硒菌特性，作者从江西某富硒泉水中取样，分离纯化亚硒酸盐还原菌，并进行分子生物学鉴定；探讨其耐硒能力与除硒效果；通过扫描电镜、红外光谱分析等技术分析细菌除硒机理。

1 材料与方法

1.1 富硒水样采集

从江西省宜春市某富硒温泉、古井及山泉中取水样，收集在预先用体积比例为5%的硝酸清洗干净的聚乙烯瓶中，水样保存在4 ℃冰箱中直至分析。试验中总硒含量采用3′3-二氨基联苯胺分光光度法测定[12]。

1.2 亚硒酸盐还原菌分离

配制LB固体培养基，取100 μL水样，采用涂布稀释与平板划线法，在25 ℃、好氧条件下，培养3 d分离出纯菌落，观察其形态特征。生理生化特征主要分析溶解氧、温度、pH、接种率、初始亚硒酸钠浓度等对菌落生长的影响。设置4因素4水平正交试验(表1)，测定细菌的最适生长条件。

表1 正交试验因素与水平设置

1.3 细菌耐硒能力测定

为了研究细菌的耐硒能力，将处于对数期的B-E细菌菌悬液(OD600=0.9)，按10%体积比比例加入到亚硒酸浓度分别为1～7 mmol/L的LB培养基中，在有氧(DO=6.56)、30 ℃、pH=7.5、转速150 r/min的恒温震荡器中反应18 h，测定OD600值，以此来衡量细菌生长情况。所有试验均设置三组平行，计算平均值与相对误差。

1.4 菌属分子生物学鉴定

通过16S rDNA基因进行分离菌株的分子生物学鉴定。DNA提取使用基因组DNA分离试剂盒(TSP101-50)进行提取，采用超微量分光光度计测定DNA浓度，以27F和1492R通用引物进行16S rRNA基因PCR扩增[10]。

PCR反应体系包含：金牌MIX酶30 μg/L、引物12 μg/L、引物22 μg/L和模板1 μg/L。扩增步骤为：首先，DNA在98 ℃下进行初始变性120 s；然后，进行35个循环，包括在98 ℃下变性10 s，在55 ℃下退火10 s，在72 ℃下延伸20 s；获得的序列在72 ℃下终延伸2 min；然后，使用ABI3730XL测序仪进行16S rDNA序列测定。用MEGA 7.0进行系统发育分析[13]，并将所得16S rRNA基因序列上传至GenBank数据库，获得基因登录号为：MF403055、MF576499、MF576500和MF576501。

1.5 亚硒酸盐还原菌除硒效果

因为亚硒酸盐还原菌可将Se(Ⅳ)还原为红色单质硒Se(0)，所以通过LB培养基颜色变化(出现红色)，可定性确定菌株对亚硒酸盐还原能力[14]。根据工业含硒废水中常见硒含量[15]，分别配制初始亚硒酸钠浓度为3.0、4.9、6.0、12.0、33.0 mg/L的人工含硒废水，分析亚硒酸盐还原菌除硒效果。

1.6 除硒机理分析

1.6.1 细菌表面形态观察

通过SEM-EDS分析除硒前、后细菌表面形态特征及元素含量。样品处理方法为：首先，用体积比例为2.5%的戊二醛固定4 h；此后，用磷酸缓冲液(PBS缓冲液)(pH7.2)洗涤3次；然后分别用体积比例为30%、50%、70%、85%、90%乙醇脱水1次，100%乙醇脱水2次，每次20 min；最后，用六甲基二硅氮烷覆盖样品，以提高样品在显微镜下可见度，将处理好的样品固定在玻璃培养皿中，在干燥器中冷冻干燥24 h；最后，利用扫描电镜(Zeiss EVO18型)观察除硒前后细菌形态，利用能谱仪分析元素组成及比例。

1.6.2 细菌官能团作用分析

用傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Nicolet Avatar 460)采集除硒前、后细菌官能团光谱特征(4 000～300 cm-1)，分析细菌官能团在硒去除中的作用。样品预处理方法：将样品冷冻干燥，与适量KBr晶体混合，完全研磨直至无小颗晶体的粉末，压制在砂浆中，进行检测。

2 结果与讨论

2.1 分离细菌特性分析

将分离得到4株细菌命名为B、C、D、E菌，它们的菌落特征相似，表现为白色、圆形、长(2.73±0.2)μm、宽(0.76±0.1)μm、表面粗糙、不透明、边缘起伏、质地柔软等。经过革兰氏染色，显示4株细菌均为革兰氏阳性菌。B-E菌的耐硒能力结果如图1所示。

当亚硒酸钠浓度为1～2 mmol/L时，B、C、D细菌OD600值变化不大，说明这三株菌生长较慢；当亚硒酸钠浓度为5 mmol/L时，4株细菌OD600均最大，代表它们生长最佳；当亚硒酸钠浓度为7 mmol/L(553 mg/L)，B、C、D细菌OD600值在2.0左右，而E细菌OD600接近3.0，表示这些细菌仍生长良好。成永丽等[13]从植物根瘤中分离出6株根瘤菌，它们对硒的耐受能力在3～6 mg/L之间。舒梅等[16]从富硒地区的农家酸菜中分离筛选出2株乳酸菌，可耐受终浓度320 mg/L的亚硒酸钠。而本实验分离的4株细菌对亚硒酸钠耐受性达到553 mg/L，说明属于超强耐硒菌。

正交试验结果如表2所示。B、C、E细菌的适宜温度35 ℃，适宜pH值为7.0或7.5，需要适宜的亚硒酸钠浓度。而D细菌适宜温度为45 ℃，不需要亚硒酸钠的条件生长良好。对于各细菌，影响因素的主次顺序为B菌：pH>温度>接种率>SeO32-初始浓度；C菌：温度> pH>接种率> SeO32-初始浓度；D菌：SeO32-初始浓度>温度> pH>接种率；E菌：温度> pH>接种率> SeO32-初始浓度。

2.2 分离细菌的菌属鉴定

将B-E菌16S rDNA基因测序所得结果，在NCBI数据库中搜索相似序列，构建系统发育树，结果如图2所示。序列比对发现4株细菌与芽孢杆菌属相似度最高(>99%)。其中，B、C、E菌与芽孢杆菌属(Bacillussp)分支更接近，而D菌与Bacilluscereus菌属在一个分支，说明B、C、E菌相互间亲缘关系较近。综合考虑B-E菌的16S rDNA基因序列相似性分析结果与系统发育树，判断分离纯化的B-E菌为芽孢杆菌属。

表2 B-E菌最适生长条件

芽孢杆菌在硒去除中有较多报道，R.R.Mishra等[17]发现巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)可在40 h内去除0.25 mmol/L的亚硒酸钠。袁永强等[18]研究了Bacillussp.SeRB-2对亚硒酸钠的还原动力学，发现Se(Ⅳ)的细菌还原符合一级反应动力学，还原反应主要集中在对数期和稳定生长前期，对1 mmol/L的Se(Ⅳ)还原效率最高可达90%，可有效降低硒污染程度。因此，本研究也继续探讨分离的亚硒酸盐还原菌除硒效果。

2.3 亚硒酸盐还原菌除硒效果

作者此前曾发现，微生物可以将高价硒还原为硒单质，使培养液变红[14]，本试验发现了类似的现象，说明B-E菌具有还原亚硒酸盐的能力。4株细菌在18 h内，对亚硒酸钠浓度为3.3、4.9、6.0、12.0、33.0 mg/L的人工废水均有很好的去除效果；对33.0 mg/L亚硒酸钠去除效果最好(>99.7%)。舒梅等[16]分离筛选出2株乳酸菌，当培养液含亚硒酸钠浓度为20 mg/L时，菌株对硒的转化率可达74.5%。而本实验分离的B-E菌去除硒能力更高。选择B菌来考察其对高浓度硒去除效果，75 h内对2.5 mmol/L(197.5 mg/L)亚硒酸钠去除情况如图3所示。

在0～20 h，总硒浓度从2.5 mmol/L下降到1.1 mmol/L，去除率为56%；对应的OD600值从接近0升高到1.6。在12～50 h，总硒浓度进一步下降到0.36 mmol/L，总硒累积去除率达到85.6%，OD600值升高到最大值2.7。此后到75 h，总硒浓度小幅度下降到0.22 mmol/L，总硒累积去除率达到91.2%，此阶段OD600值略有下降，但依然保持在2.2以上。本研究分离的芽孢杆菌除硒能力高于此前报道的巨大芽孢杆菌[17]、Bacillussp.SeRB-2[18]等，说明分离的细菌具有处理高浓度含硒废水的潜力。

2.4 除硒机理分析

2.4.1 细菌表面形态及元素变化

将处理高浓度含硒废水的B菌，进行SEM-EDS分析，结果如图4所示。放大20 000倍后的SEM结果显示，细菌成杆状，宽约0.8～1 μm，长约1.2～2 μm，与此前报道的芽孢杆菌形态类似[18]。除硒前细菌形态饱满、表面光滑，除硒后细菌表面出现褶皱，少部分细菌塌陷，但大部分细菌依然形态完整。这表明分离的芽孢杆菌能够耐受高浓度亚硒酸盐。

EDS结果显示，除硒前，细菌表面未含有硒元素。而除硒后，表面积上出现明显的硒峰(1.38～1.40 keV)，表明细菌表面存在一定量的硒。统计元素含量分析，发现硒元素占细菌表面元素比例的9.87%(表3)，可确定细菌对硒的富集作用。

2.4.2 细菌官能团作用分析

与其它官能团峰位变化幅度相比，羟基、蛋白酰胺带Ⅱ的酰胺基峰位变化最显著，移动约80 cm-1；蛋白酰胺带I基团峰位移动约17.5 cm-1。推测此变化主要是由于亚硒酸根离子与羟基、酰胺基之间的相互作用引起的[19]，即酰胺基及羟基团在亚硒酸钠吸附去除中起到重要作用。因此，亚硒酸盐还原菌对硒除了有还原效果之外，还有吸附作用，具体还原机理，将在后续研究中探讨。