中药精液消毒剂的消杀效果及安全性评价研究

范建华，赵华轩，李尚民，蒋一秀，孙常法，姚勤光，窦新红*

(1.江苏省家禽研究所，江苏扬州 225003；2.江苏省家禽遗传育种重点实验室，江苏扬州 225003；3.江苏康世源药液有限公司，江苏新沂 221400)

在畜禽养殖中，垂直传播疾病一直困扰着我国畜牧业健康发展[1]。垂直传播疾病，除了蛋胚源媒介外，另外一个重要环节就是公畜禽通过配种(包括人工授精和自然交配)，将精液含有的病原微生物传给母体，其受孕的过程可能就是病原传播的过程。在生产实践中，曾发生过多种垂直传播疾病，如猪蓝耳病、猪瘟、猪圆环病毒病、禽流感、禽白血病、鸡传染性贫血等[2,3]，不仅给养殖业造成巨大的经济损失，而且还会通过种代扩繁传播至下一代[4]，造成更大范围的感染。

目前解决种畜禽精液中带菌或带毒问题的最常见方法是，在精液稀释过程中适量添加抗生素进行消毒。但该方法对病毒的作用微乎其微，并存在因长期应用而导致的细菌耐药性问题，而且还对精液精子活力存在极大的伤害[5-7]。

为此，本研究对新创制开发的一种中药精液消毒剂进行了体外抑菌杀毒和急性毒性、刺激性，以及临床应用等安全性评价实验，以期为今后进一步研制一种安全高效的中药精液消毒剂产品奠定基础。

1 材 料

1.1 试验菌(毒)种 实验选用的细菌禽巴氏杆菌C48-1 株、鸡白痢标准株YD2 株、大肠杆菌C15003 株和金黄色葡萄球菌YD-1 株均为本实验室保存菌株；选用的新城疫病毒F48E8为扬州大学兽医学院惠赠。

1.2 试验动物 实验选用的BABC小鼠、新西兰大白兔和鸡胚等均为市购。

1.3 主要仪器设备 主要仪器设备包括超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、高效液相色谱仪、电子显微镜、中药混悬液均质机、实验动物饲养笼具和小型孵化器等。

2 方 法

2.1 中药精液消毒剂的制备 按成分重量比，取板蓝根、苦楝、地榆、大青叶和芦荟提取物各1.5%、果糖3.0%、甘油4.0%、柠檬酸钠2.5%、维生素C 0.3%、余量为去离子水混合，并用柠檬酸钠调至PH值7.5±0.2，在37℃、转速为20～25 转/分的条件下低速搅拌30 分钟混匀，经过滤除菌后澄清、透明溶液即为本实验用中药消毒剂。

2.2 对病原微生物的杀灭试验

2.2.1 对4种有害菌的体外抑菌试验 采用打洞法[8]开展受试消毒剂对4种致病菌的药敏试验，根据抑菌圈直径>20 mm为极敏，15～20 mm为高敏,10～14 mm为中敏，<10 mm为低敏来判定受试药物敏感度高低[9]；将受试消毒剂用生理盐水按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀释，测定其对4种致病菌的最小抑菌浓度。

2.2.2 对鸡新城疫病毒(NDV)的杀灭试验

2.2.2.1 鸡新城疫病毒(NDV)的定性杀灭试验 采用鸡胚感染法[10]，将受试消毒剂用去离子水稀释成1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000的梯度浓度下各2.5 mL，在室温条件下与2×105EID502.5 mL的新城疫病毒分别感作5、15和30 min，接种10 日龄的鸡胚，24 h后观察鸡胚死亡情况。

2.2.2.2 鸡新城疫病毒(NDV)的定量杀灭试验 将新城疫病毒液稀释成2×105EID502.5 mL，分别加入三个不同浓度的消毒剂1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000各2.5 mL，以PBS作为对照组。充分摇匀，置室温5 min，吸取混合液1 mL加入9 mL硫代硫酸钠中和剂，作用10 min后，测定各组病毒滴度EID50值。EID50值参照Reed-Muench方法[11]计算。

2.3 安全性评价试验

2.3.1 急性毒性试验 选择体重约20 g的BABC小鼠雌雄各10 只。取原药液10 mL加去离子水20 ml稀释作为供试液，按0.1 mL/10 g.BW的剂量一次性经口灌胃，最大限度灌胃剂量设计5000 mg/kg.BW(按体积重量比折算，5000 mg为灌胃液中含原药液总重量)，连续2 周观察小鼠的采食、饮水及精神状态情况，计算体重变化、中毒死亡只数。

2.3.2 刺激性试验

2.3.2.1 皮肤刺激性试验 选择健康无眼部疾病，体重约2.3 kg的新西兰大白兔3 只。试验前24 h，将兔子背部脊柱两侧去毛，去毛范围3 cm×3 cm，第二天在左侧去毛部位划出2.5 cm×2.5 cm试验区，在其上将受试消毒剂原液0.5 mL均匀涂布，并覆盖2～4层同样大小的纱布和一层稍大的玻璃纸，再用无刺激的胶布固定，使受试消毒剂与皮肤直接接触4 h。右侧作为对照。试验结束后除去覆盖物，并用温水洗净。分别记录除去覆盖物后的2 周内的皮肤刺激反应。

2.3.2.2 眼睛刺激性试验 选择健康无眼部疾病，体重约2.3 kg的新西兰大白兔3 只。将动物左侧眼睑轻轻分开，吸取0.1 mL受试消毒剂原液滴入眼结膜囊内，右侧眼滴入等量的生理盐水作为对照。滴眼后将上下眼闭合30 s，再用生理盐水冲洗，除去受试药品。分别于滴眼后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d和21 d，观察兔子角膜、虹膜和结膜刺激反应。

2.3.3 精子活力影响试验

2.3.3.1 常温保存条件下对精子生存指数影响 将新鲜采集的种公鸡精液，在37 ℃水浴条件下，按照1∶2分别加入原液受试消毒剂、10倍原液稀释受试消毒剂和100倍原液稀释受试消毒剂，以及生理盐水对照，然后在20℃条件下，每隔2 h观察精子的存活情况，最终统计精子生存指数。

2.3.3.2 冻融条件下对精子存活率影响 将活力不低于0.7，密度在0.8～1.0×108/ml精子，按照有关参考文献方法，分别在原液受试消毒剂、10倍原液稀释受试消毒剂和100倍原液稀释受试消毒剂中冷冻再解冻，并设生理盐水作为对照，观察冻后精子的存活率。

2.3.4 对种公鸡精液消毒后的次代孵化率和出雏率影响试验 将新鲜采集的种公鸡精液，在37℃水浴条件下，按照1∶2分别加入10倍稀释的受试消毒剂和12%的甘油稀释，并设生理盐水对照。然后按正常生产方式人工授精和收集种蛋，进行孵化，分别记录种蛋受精率和孵化率。取两次测定结果的平均值作为最终结果。

3 结果与分析

3.1 对病原微生物的杀灭效果

3.1.1 对4种鸡有害菌的杀灭效果 由药敏试验结果可知，该消毒剂对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为18 mm，属于高度敏感，对沙门氏菌、禽巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径范围为11～12 mm，均为中度敏感；稀释16倍后，对禽巴氏杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为62.5 mg/mL，稀释32倍后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为31.3 mg/mL。具体结果见表1和表2。

3.1.2 对鸡新城疫病毒(NDV)的杀灭效果 对NDV的定性杀灭结果表明，受试消毒剂按1∶400及以上浓度稀释，最短作用时间5 min，即对NDV具有良好的杀灭效果，病毒杀灭率为100%，达到国内规定的消毒剂消毒标准。具体结果见表3。

对NDV的定量杀灭结果表明，受试消毒剂按1∶400及以上浓度稀释，鸡胚无死亡，病毒灭活率为100%。具体结果见表4。

表1 中药消毒剂药敏试验测定结果Tab 1 Results of drug sensitivity test of traditional Chinese medicine disinfectant

表2 中药消毒剂最小抑菌浓度Tab 2 MIC of traditional Chinese medicine disinfectant

表3 中药消毒剂对NDV的定性杀灭结果Tab 3 Qualitative killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

注：*为阳性鸡胚数/试验鸡胚数

Note: * Positive Embryo Count / Test Embryo Count

表4 中药消毒剂对NDV的定量杀灭结果Tab 4 Qualified killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

3.2 安全性评价

3.2.1 急性毒性试验结果 由表5可知，17 d观察期内，20只受试小鼠体重逐渐增加，未见任何中毒体征和死亡。受试消毒剂经口半数致死量LD50>5000 mg/kg。根据急性毒性评价规定，该消毒剂为无毒级。

表5 小鼠急性毒性试验结果Tab 5 Results of acute toxicity test in mice

3.2.2 皮肤和眼睛刺激性试验结果 表6试验结果表明，受试消毒剂连续对新西兰大白兔皮肤涂抹14 d，试验期间未见红斑和水肿等异常反应，刺激指数为0，对皮肤无刺激。表7试验结果表明，给药期间，受试动物眼均未出现角膜和虹膜损害以及结膜水肿或充血现象，眼刺激平均评分为0，也未见全身中毒，对眼睛无刺激。

表6 大白兔的皮肤刺激反应评分Tab 6 Skin irritation response scores of white rabbits

表7 大白兔的眼部刺激反应评分Tab 7 Eye irritation response scores of white rabbits

3.2.3 对精子活力的影响 由表8可知，常温保存下，精子中加入受试消毒剂组生存指数均低于生理盐水对照组，原液组和100倍稀释组差异显著(P<0.05)，但10倍稀释组差异不显著(P>0.05)；3个梯度受试消毒剂组间，10倍稀释组要显著高于其它两组(P<0.05)。由表9可知，在冷冻条件下，受试消毒剂组精子的存活率均显著高于对照组(P<0.05)，且10倍原液稀释受试消毒剂组差异极显著(P<0.01)。

表8 种公鸡精液中精子的中生存指数Tab 8 Median survival index of spermatozoa in semen of breeder cocks

注：肩头双字母中有一个不同，均表示差异显著(P<0.05)。

Note: There was one difference of double letters in shoulder， which indicated significant difference (P< 0.05).

表9 中药消毒剂对种公鸡精液中精子冷冻保护效果Tab 9 Cryopreservation effect of traditional Chinese medicine disinfectant to breeder cocks sperm

注：肩头字母不同，表示差异显著(P<0.05)。

Note: The difference of shoulder letters is significant (P< 0.05).

3.2.4 对鸡次代孵化和出雏率的影响 中药精液消毒剂与精液作用后，对蛋鸡受精率和孵化率影响结果(表10)表明，3个组别对蛋鸡受精率和孵化率影响差异不显著(P>0.05)，但受试消毒剂组和甘油组效果略佳。

4 讨论与结论

常见的畜禽消毒剂(如抗生素和各种化学试剂)虽然能够有效抑制或杀灭病原微生物，但都因为安全性问题很难在种畜禽精液中应用[12]。本试验研发的中药消毒剂选用的板蓝根、苦楝、地榆、大青叶、芦荟等中草药提取物，具有清热解毒、杀菌消炎等实际功效，能够杀灭多种病毒和有害菌[13]；果糖能够为精子提供营养和能量[14]；甘油是常用的抗冻保护剂，能够防止精原细胞脱水，延迟精液保存时间；柠檬酸钠能调节精液的pH值，起缓冲保护和平衡电解质的作用；维生素C可以抗氧化并为精子提供营养。同时，各成分间功效相互增益，相互协同，对精液有较好的消毒效果。

表10 中药精液消毒剂对蛋鸡受精率和孵化率的影响Tab 10 Effect of traditional Chinese medicine semen disinfectant on fertilization rate and hatching rate of laying hens

通过药效学试验可知该中药消毒剂对大肠杆菌、沙门氏菌、禽巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌有普适性，其中对大 肠杆菌杀灭效果最强。稀释400倍的中药消毒剂作用5 min，即对NDV具有良好的杀灭效果，达到国内规定的病毒杀灭率标准[15]。随着稀释倍数增加，中药消毒剂的杀灭效果降低，作用时间延长，杀灭效果增强，因此在实际使用时要按照具体情况，灵活调整消毒剂的浓度和作用时间，以达到彻底杀灭致病菌和病毒的目的。

通过急性经口试验、皮肤和眼睛刺激试验可知，该消毒剂安全无刺激性。而申玉玺等[16]报道发现5种低毒化学消毒剂在低浓度下就可以有效灭活新城疫病毒，虽然安全性相对较高，但仍需另加化学缓冲剂中和残留消毒剂，以减少和试验细胞的损伤。

此外，本中药消毒剂对常温下种鸡精液中精子的生存指数影响不大，且能显著提高冷冻条件下精子的存活率，同时还提高了蛋鸡受精率和次代孵化率，可能均与该中药消毒剂对精液中病原微生物的杀灭作用有关。其中10倍稀释组要明显优于原液组和100倍稀释组。笔者分析，消毒剂浓度偏高使得药液中鞣酸、碱等有效成分也偏高，因而对精液精子的刺激伤害作用也增大，而消毒剂浓度降低，其中果糖和维生素C等精子有效保护因子也相对减少。因此，该消毒剂在临床应用时，要想既能达到杀灭精液中病原微生物的效果，又要最大限度地减少精子的损害，必须选择一个适中稀释消毒浓度。

本试验研发的中药消毒剂原液在400倍及以上浓度稀释应用，可对大肠杆菌等4种常见病原菌有较好的消杀效果，在5 min内对新城疫病毒有100%杀灭率；经口灌胃急性毒性试验和粘膜染毒刺激性试验表明该消毒剂安全无毒无刺激；该消毒剂对种公鸡精液精子刺激性影响不大，且对冻融条件下精子有较好的保护效果；通过人工授精和孵化等试验证明，该消毒剂对提高蛋鸡受精率和次代孵化率有显明效果。

综上研究，建议对种畜禽精液消毒的临床最佳方法为：在人工输精前，将该中药消毒剂用去离子水按10倍量稀释后，按1∶2与采集的精液体积稀释，并互作至少5 min。