四味穿心莲散中大青叶的薄层色谱定性鉴别方法

班燕桃，严 明，严 寒，单乃荣，吴 涛，陈 幸，陈宝宇

(广西兽药监察所，南宁 530001)

四味穿心莲散是由穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶四味中药材经粉碎、过筛、混匀制成的，收载于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部的成方制剂，具有清热解毒、除湿化滞的功能，主要用于泄痢和积滞的治疗[1]。在目前的质量控制方法中，收载了3味中药的显微特征鉴别和穿心莲的薄层鉴别方法。组方中的大青叶为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥叶，主要化学成分为吲哚类、喹唑酮类、芥子苷类、有机酸类和氨基酸类化合物等[2]，大青叶抗氧化活性成分主要集中在极性较低的化学组分中，其主要有效成分为吲哚类、喹唑酮类和有机酸类化合物，糖类和氨基酸类化合物的抗氧化活性较弱[3]。药理研究表明，其具有较强的抗菌、抗病毒、增强机体免疫力、解热、抗炎、利胆等作用[4]。为了完善本产品的质量控制方法，提高产品质量，本文对组方中大青叶的薄层鉴别方法进行了研究。结果表明所建立的方法简单、快速、灵敏，可以作为该散剂的质量控制标准。

1 材料与方法

1.1 仪器 上海精密科学仪器有限公司YP802N电子天平，感量0.01 g；KQ-250DB型数控超声波清洗器；微量移液器5 μL，美国Drummond Microcaps®微量毛细管；硅胶G薄层板(200 mm×200 mm，MERCK公司，批号：HX87777184)；双槽玻璃层析缸。

1.2 试剂 大青叶对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121367-201403)、甲醇、环己烷、丙酮、三氯甲烷均为分析纯。

1.3 供试品 自配四味穿心莲散样品1批，从广西玉林市药材市场购进原料药材，按《中华人民共和国兽药典》2015年版二部收载的药材标准检验符合规定。按成方制剂四味穿心莲散的处方投料，混合粉碎，过二号筛，混匀，即得。分别派员监制获得企业A样品，批号20170901、20170902、20170903；企业B样品，批号20171001、20171002、20171003；企业C样品，批号20171201、20171202、20171203。

1.4 阴性对照样品 未添加大青叶的“四味穿心莲散”同供试品制法制得。

1.5 供试品溶液的制备 取供试品2.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL溶解，作为供试品溶液。

1.6 对照品药材溶液的制备 取大青叶对照药材0.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL溶解，作为对照药材溶液。

1.7 阴性对照溶液的制备 取不含大青叶的“四味穿心莲散”阴性对照样品2.5 g，按照1.5项下的方法，制成阴性对照溶液。

1.8 薄层鉴别与检视方式 吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，立即观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同的蓝色斑点和浅紫红色斑点。

2 结果与分析

按兽用中药质量标准分析方法验证指导原则进行方法验证，结果如下。

2.1 重复性试验 采用3家企业各3批供试品，按1.5项下制成供试品溶液进行实验，图1实验结果表明该方法重复性好，溶液中待测成分稳定。

1.阴性样品(缺大青叶) 5μL；2.大青叶对照药材5μL；3-5.企业B供试品(20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.企业A供试品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企业C供试品(20171201、20171202、20171203) 5μL；12.自制样品 5μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5μL；2.Isatidis Folium control herbs 5μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.Test article of A factory (20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203) 5μL；12.Self made sample 5μL图1 薄层板(MERCK)Fig 1 TLC (MERCK)

2.2 重现性试验 在不同实验室复核结果中，在使用规格为(100 mm×200 mm)的薄层板时，青岛海洋化工厂分厂(批号20160402)和烟台市化学工业研究所(批号111218)的分离效果好，分别显相同的蓝色斑点和浅紫红色斑点，阴性无干扰(图2、图3)，使用MERCK公司薄层板(批号HX61216826)时，当上行展开7 cm，存在斑点前沿稍滞后，靛玉红斑点分离良好，靛蓝斑点与其他斑点有时不能完全分离，会影响结果判定(图4)，在实验时可适当伸长展距，得到良好的分离效果。

2.3 耐用性试验 此薄层色谱鉴别方法在相同来源不同批号(青岛海洋化工厂分厂：20170410、20180616、20181212)和相同规格(100 mm×200 mm)不同来源的薄层板(手工铺制：20190220、青岛海洋化工厂分厂：20180616、烟台市化学化工研究所：20181109)上的分离效果相近，分别显相同的蓝色斑点和浅紫红色斑点，阴性无干扰。在不同温度、湿度条件下，色谱图的分离效果相近，表明该展开条件受温度湿度的影响较小，可靠性强。

1.阴性样品(缺大青叶) 5 μL；2.大青叶对照药材5 μL；3-5.企业B供试品(20171001、20171002、20171003) 5μL；>6-8.企业A供试品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企业C供试品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制样品5 μL;1. Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5μL； 6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5μL图2 薄层板(青岛海洋化工厂分厂)Fig 2 TLC (Qingdao Ocean Chemical Plant Branch)

1.阴性样品(缺大青叶) 5 μL；2.大青叶对照药材5 μL；3-5.企业B供试品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企业A供试品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企业C供试品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制样品5 μL;1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL； 3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL图3 薄层板(烟台市化学工业研究所)Fig 3 TLC (Yantai Institute of chemical industry)

1.阴性样品(缺大青叶) 5 μL；2.大青叶对照药材5 μL；3-5.企业B供试品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企业A供试品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企业C供试品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制样品5 μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory(20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5 μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL图4 薄层板(MERCK)Fig 4 TLC (MERCK)

3 讨论与结论

3.1 提取方法的优化 按《中华人民共和国兽药典》2015年版二部第29页中收载的大青叶薄层鉴别方法(2)进行验证，色谱结果中供试品与对照药材相应的位置上，展开结果靛蓝斑点位置上无干扰，靛玉红斑点有黄绿色杂质干扰。在供试品溶液的制备方法中考察了不同溶剂、溶剂用量比例及提取方式：①取样品加三氯甲烷超声提取，滤过，滤液蒸干，三氯甲烷溶解作为供试品溶液；②取样品加无水乙醇超声提取，滤过，滤液蒸干，三氯甲烷溶解作为供试品溶液；③取样品加甲醇超声提取[5]，滤过，滤液蒸干，三氯甲烷溶解作为供试品溶液；④取样品加甲醇浸泡[6]30 min再超声提取，滤过，滤液蒸干，三氯甲烷溶解作为供试品溶液。结果以方法④效果较好。选择甲醇作为本研究的提取溶剂，主要考虑到用量比较大，且甲醇属于低毒毒性，稳定性良好，而氯仿毒性较强，也有文献报道靛玉红在氯仿溶剂中稳定性较差[7]，同时也改善样品溶液的粘稠度，易于点样。

3.2 展开剂的优化 展开剂考察中进行了苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)[1,8]、苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)[9]、环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶0.5∶1)、环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶1∶1)、环己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶8∶1)、环己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)等试剂不同配比试验研究，因为苯的毒性大，长期使用会对检测工作人员的身体健康造成危害，也会对环境造成一定影响，所以最终选择低毒的环己烷代替苯作为展开剂的一种。结果表明前五种配比试验样品斑点有干扰，色谱分离度较差，不予采用，而以环己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)作为展开剂得到的色谱分离度及斑点相对位置重现性好。为避免产生边缘效应，本展开剂系统应至少饱和半个小时，展开时应保持密闭状态。

3.3 薄层板的选择 参照《中华人民共和国兽药典》中大青叶药材的薄层鉴别方法选择使用硅胶G薄层板，在重现性实验中，当使用规格为100 mm×200 mm MERCK薄层板时，出现影响结果判定的现象(图4)。MERCK板是进口产品，购买时间较长，相对其他板价格昂贵，目前采用进口板的实验室相对比较少。而使用青岛海洋化工厂分厂和烟台市化学工业研究所薄层板时，达到很好的分离效果，重现性较好，阴性无干扰(图2、图3)。这两种板属于国内生产产品，在市面上容易购得，价格也比较实惠，可以降低分析成本，得到大多数实验室的青睐。虽有瑕疵，但对方法使用影响较小。

3.4 对照药材的选择 由于我国南北纬度、气候等因素差异较大，不同产地生产的大青叶外观品质和质量之间会有很大差异，从而引起有效成分种类和成分间配比的变化[10]。由于样品提取成分复杂，经实验分别采用大青叶对照药材与靛蓝、靛玉红对照品作为质控指标相比较，在薄层鉴别上采用大青叶对照药材作为质控指标产生靛蓝、靛玉红斑点大小合适，颜色清晰，专属性强，可同时解决复方组成药味的真伪(或有无)和优劣(或剂量)等问题，已达到质量控制的效果，所以选用大青叶对照药材为参照。由于靛蓝易氧化褪色，薄层板取出后应立即观察。

本研究建立了四味穿心莲散中大青叶的薄层色谱鉴别方法，说明四味穿心莲散的质量可控，且方法简便，方法专属性强，可为建立和完善四味穿心莲散中大青叶的质量标准提供依据。