甜叶菊叶斑病的病原鉴定和杀菌剂防治效果

陈叶，杨磊磊，王媛，马银山，王治江

（1.河西学院农业与生态工程学院，甘肃张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖 734000）

0 引言

甜叶菊（Stevia rebaudianaBertoni）又名甜草、甜菊，为菊科多年生草本植物[1]。经大量药物实验证明，甜菊糖无毒副作用，无致癌物，食用安全，经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症，是一种替代蔗糖非常理想的甜味剂[2-4]。目前，甜菊糖已被广泛应用于食品、饮料和医药等行业，是新型糖源植物[5]。在我国甜叶菊的种植主要集中在南方地区，近年来，引种到甘肃河西走廊种植。

河西走廊位于甘肃省中西部，属于祁连山冷凉灌溉区，光照资源丰富，昼夜温差大，气候干燥，无霜期127～158 d，10 ℃以上有效积温3 000～4 000℃，非常适宜甜叶菊的生长[6]。自甜叶菊被引种到甘肃河西地区种植以来，呈现量效齐升的状态，已经发展成为当地的新兴产业之一。但随着甜叶菊栽培年限的增长和面积的扩大，甜叶菊病害的发生与危害日益严重[7]，成为制约经济效益提升和产业发展的瓶颈之一。笔者对甘肃省临泽县甜叶菊种植田的调查发现，甜叶菊叶斑病（Septoria steviae Ishiba Yokoyama et Tani）发生最普遍、危害最严重，且有逐年加重的趋势，严重发病地块发病率达90%以上，甜叶菊减产50%～60%。此前，林双喜等研究表明甜叶菊斑枯病的发生特点为发生面积大、为害周期长、品种间发病程度有差异、发病损失重[8]，因此，对甜叶菊叶斑病的防治对甜叶菊种植至关重要；王光华等对甜叶菊斑枯病的防治进行药剂试验，结果表明，田间小区防治试验以甲基托布津防治甜叶菊斑枯病效果最好，防效可达90%以上，其次是百菌清、福美双和多菌灵[9]；罗明华等人对四川绵阳地区甜叶菊叶斑病的发病特征进行了调查并筛选出75%百菌清、50%乙基托布津、65%代森锌的防治效果较好[10]；程爱均针对济宁地区甜叶菊叶斑病提出在种植时选择适宜的密度、提供必需的营养元素、使用高效杀菌剂来进行防治[11]。但目前尚未见临泽县甜叶菊种植田中叶斑病的相关研究报道，对于此病的防治，种植户没有针对当地叶斑病的配套措施，防治效果不佳，目前，叶斑病害已经成为当地危害甜叶菊产量和菊糖苷质量的最大病害。为此，本试验针对叶斑病进行了田间病害调查、菌种分离、病原鉴定及室内药剂防效研究，以期为甜叶菊叶斑病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂与培养基

甲基硫菌灵70%WP（广东中迅农科股份有限公司生产）；粉绣宁15%WP（四川国光农化股份有限公司生产）；百菌清75%WP（利民化工股份有限公司生产）；吡唑醚菌酯20%SC（利民化工股份有限公司生产）；代森锰锌70%WP（利民化工股份有限公司生产）；苯醚甲环唑10%WDG（利民化工股份有限公司生产）。

1.1.2 供试病株

2018 年6 月从临泽县甜叶菊种植基地采集患有叶斑病的甜叶菊病叶，将叶片从茎秆上摘下后放在培养皿中，内铺吸水纸，吸水纸用蒸馏水浸湿即可，带往河西学院生命科学实验楼，置于冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 田间发病率和病害特征调查

分别在2018年5月、6月、7月、8月的下旬前往临泽县甜叶菊种植基地，采用实地调查和走访农户相结合的方法，设置4个样点，调查叶斑病的发病率，记录病害症状、发病特点和发病部位及程度。

1.2.2 菌种分离、纯化

选取病症明显的叶片，在病健交接处割取0.5 cm×0.5 cm 大小的叶片，先将叶片浸在0.1%氯化汞溶液中15 min，然后用无菌水冲洗后，再浸入75%酒精溶液中15 s，然后用无菌水冲洗后，沥干水分后放置于PDA平板培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养，5 d 后病叶边缘长出病原菌菌丝；用挑针挑取少量菌丝转接到PDA平板培养基上进行初步纯化培养，按照此方法纯化转接3～4 次后，将经过纯化的菌种转接到PDA 斜面培养基上，待斜面长满菌丝后，放入4 ℃冰箱中保存备用[12]。

1.2.3 病原鉴定

将纯化后的菌种接种至PDA 培养基平板上，在培养过程中定期观察并记录菌落形状、质地、颜色以及生长速度等情况。从培养一定时间的菌落上挑取菌丝制成玻片，显微镜下观察真菌菌体的形态特征，即菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形状、大小、颜色等或其它繁殖体形态。依据真菌分类进行鉴定[13]。

1.2.4 含药培养基制备

分别称取甲基硫菌灵、粉锈宁、百菌清、代森锰锌、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑6 种可湿性粉剂的对应量倒入从高压灭菌锅中取出的PDA 培养基中（待温度冷却至45 ℃时），制成含药培养基平板。药剂的对应量为每个药剂使用浓度的最高、最低和中间值为对应浓度（见表2）。

1.2.5 抑菌测定

采用菌丝生长速率法，将供试甜叶菊叶斑病菌种在含药培养基上分别进行6种杀菌剂苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、粉锈宁、代森锰锌、百菌清、甲基硫菌灵的抑菌测定。在保存新鲜的甜叶菊叶斑病菌菌落边缘打取直径6 cm 的菌饼，接种于含药培养基的平板中央，菌丝面朝下，每皿一个菌饼，以不加药剂平板作为空白对照，每个处理重复5 次，在25 ℃恒温箱中培养5 d 后，用十字交叉法测量菌饼的生长直径，通过净生长量的计算，求出抑制率（抑菌率)[7]。以杀菌剂质量浓度对数值为横坐标，抑菌率概率值为纵坐标绘制毒力回归曲线，根据毒力回归方程求出各杀菌剂对病原菌各菌株菌丝生长有效抑制中浓度EC50，每种杀菌剂3 次重复的平均值即为该杀菌剂对甜叶菊叶斑病菌菌丝生长的EC50。

2 结果与分析

2.1 发病率及病害特征

由表1 可知，从5 月到8 月甜叶菊叶斑病在田间的发病率为11.2%～65.6%，随着月份的增加，发病率呈上升趋势，严重发病地块发病率达90%以上。在植株发病初期，在叶片上出现浅色病斑，病斑先从植株下部叶片上发生，由下而上蔓延，病斑大小约在2～13 mm，初期时斑点较小，随后逐渐发展成大的长形、不规则形的褐色或黑褐色病斑，病斑中间出现小黑点，边缘黄化，严重时多斑联合，重者整个叶片枯死。调查还发现，发病后期部分叶片脱落，特别是贴近地面部分发病最严重，脱落最多。

表1 甜叶菊叶斑病田间发病率调查结果Table 1 Field incidence rate of stevia leaf spot disease

2.2 菌种鉴定

将菌种培养一周后观察，生长特征为：前期菌落呈现浅绿色,后期转为橄榄绿至褐色，气生菌丝比较丰富，呈现棉絮状（图1a）；显微镜下观察得分生孢子梗单生或簇生，大多直向少数偏向一侧弯曲，有分隔，用目镜测微尺测得分生孢子大小为17.60～23.80µm×8.80～12µm，平均为21.60µm×10.60µm，呈倒棍棒形、长卵圆形或梭形等；有2～5 个横隔、0～2 个纵隔，喙较短，呈现柱形状，大小为2.74～4.50µm×2.40～4.16µm，无分隔（图1b）。将分离后的菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，然后将盆栽的甜叶菊叶片用细纱布轻轻地摩擦，将菌悬液喷洒在摩擦后的叶片上，保湿培养，结果在叶片上出现与甜叶菊田间病害症状一致的病斑。根据真菌分类初步鉴定临泽县当地甜叶菊叶斑病菌为链格孢真菌（Alternariasp.），属半知菌纲、链孢霉目、黑霉科。

2.3 不同药剂对甜叶菊叶斑病菌的抑菌效果

由表2和图2可知，不同药剂对甜叶菊叶斑病菌菌丝生长均有抑制作用，同一药剂的抑菌效果随浓度的减小而降低。用苯醚甲环锉处理的抑菌圈直径为0.26～0.40 cm，抑菌率为90.00%～93.50%，其中，10%苯醚甲环唑50 µg/mL 抑菌效果最好。用吡唑醚菌酯处理的抑菌圈直径为0.28～0.42 cm，抑菌率为89.50～93.00%，抑菌效果仅次于苯醚甲环锉，其中，20%吡唑醚菌酯80µg/mL抑菌效果最好。用粉锈宁的抑菌圈直径为1.03～1.20 cm，抑菌率为70.00～74.25%，其中，15%粉锈宁134µg/mL抑菌效果最好。用代森锰锌处理的抑菌圈直径为1.53～1.67 cm，抑菌率为58.25～61.75%，其中，280µg/mL时抑菌效果最好。用百菌清处理的抑菌圈直径为1.51～1.66 cm，抑菌率为58.50～62.25%，而甲基硫菌灵的抑菌效果较差，抑菌圈直径为2.03～2.22 cm，抑菌率最高仅为49.25%。由此可以看出，用10%苯醚甲环唑50µg/mL和20%吡唑醚菌酯80µg/mL的抑菌效果（93.50%、93.00%）最好。

表2 不同药剂对甜叶菊叶斑病病菌的抑菌效果Table 2 Antimicrobial effects of different bactericides on stevia leaf spot

图2 6种药剂最高稀释倍数抑菌效果Fig.2 Bacteriostasis effect of maximum dilution multiple of six bactericides

2.4 甜叶菊叶斑病菌与不同杀菌剂间敏感性回归分析

利用回归统计方法，将浓度转换成对数和百分率转换成机率值，分别求出甜叶菊叶斑病对6 种杀菌剂相关回归方程和相关系数、有效抑制中浓度EC50。如表3所示，甜叶菊叶斑病菌对苯醚甲环锉和吡唑醚菌酯的敏感EC50值最低，分别为3.43µg/mL和10.85µg/mL，说明甜叶菊叶斑病菌对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯表现敏感，也说明抑菌效果最好；而对粉锈宁、代森锰锌、百菌清、甲基硫菌灵的EC50值分别为23.15 µg/mL、76.92µg/mL、49.10µg/mL和75.75µg/mL，说明甜叶菊叶斑病菌对代森锰锌、甲基硫菌灵和百菌清产生较强的抗药性，其中，对代森锰锌和甲基硫菌灵的抗性最大，也说明二者抑菌效果最差。

表3 甜叶菊叶斑病菌与6 种药剂敏感相关回归分析Table 3 Regression analysis of correlation between stevia leaf spot and 6 kinds of bactericides

3 讨论与结论

在甜叶菊生长过程中，叶斑病（Septoria steviae Ishiba Yokoyama et Tani）是发生较为普遍的一种病害，造成直接的产量和品质的损失[14-15]。目前防治甜叶菊叶斑病的药剂报道较多，但各地防治的效果各不相同[16-18]。本试验结果表明，甜叶菊叶斑病在田间的发病率为11.2%～65.6%，严重发病地块发病率达90%以上，并且病害的发生随着月份的增加而增加，在防治时以早防为主。通过6种药剂对甜叶菊叶斑病抑菌效果与敏感性分析，10%苯醚甲环唑50 µg/mL 和20%吡唑醚菌酯80 µg/mL 时的抑菌效果最好，抑菌率分别为93.50%和93.00%，而70%甲基硫菌灵和70%代森锰锌的抑菌效果最差。张金兰等研究认为大田种植的甜叶菊上发生的叶斑病为甜菊叶斑病Septoria steviae，是随日本甜叶菊种苗带入的一种国内新记录病害，该病病原为壳针孢属真菌[19]。本试验初步鉴定临泽县甜叶菊叶斑病菌为链格孢真菌（Alternariasp.），属半知菌纲、链孢霉目、黑霉科，可能与生长地不同，使叶片产生病斑的真菌也不同有关。为此，建议对临泽县甜叶菊种植田的叶斑病选用10%苯醚甲环唑50µg/mL 或20%吡唑醚菌酯80µg/mL 药剂进行防治。为提高防效、防止产生抗药性，可交替使用这两种药剂，以达到经济、安全、有效的目的。本试验所选出的药剂仅仅是实验室测定得出的结果，在大田中效果如何有待今后进一步验证。