去肾交感神经术对大鼠下丘脑血管紧张素II 及其受体的影响

安玉楠,马艺杰,王丽,2,李竹青,卢成志,2

（1 天津医科大学研究生院，天津300070；2 天津市第一中心医院心内科，天津300192）

高血压作为一种慢性疾病影响着全世界大约40%的成年人口［1］，而在接受治疗患者中，血压的有效控制率仅为37.5%，是导致心力衰竭、卒中、慢性肾病甚至死亡的主要原因，作为心血管事件和死亡的可改变风险因素，控制高血压可以改善心血管结局。抗高血压药物如利尿剂、β 受体阻滞剂、钙通道阻滞剂（calcium channel blocker，CCB）、血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACEI）和血管紧张素II 受体阻滞剂（angiotensin II receptor blocker，ARB）等在临床治疗中取得了不错的疗效，但是还有一部分患者血压得不到理想的控制，针对这个现象，器械治疗如：射频消融导管系统、颈动脉窦压力感受器器械治疗、中央动静脉吻合术、颈动脉体消融等应运而生。其中射频消融导管系统中的去肾交感神经术（renal sympathetic denervation，RDN）是被临床应用最广泛的一种非药物治疗高血压的方式。特别是近年来Symplicity Spyral HTN-OFF 和Symplicity Spyral HTN-ON 研究结果的发布，证实了RDN 可显著降低患者血压［2-4］。本研究组已有研究成果表明RDN 可以通过降低肾交感神经活性降低肾素-血管紧张素-醛固酮（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）活性，从而降低患者血压，然而RDN 对于中枢系统调控血压的作用机制不够明确。因此，本研究希望通过观察RDN对于高血压大鼠的血压及相关指标变化，进一步了解RDN 对于大鼠中枢系统的影响；对于特异性神经损伤因子的监测，寻找RDN 治疗有效性的判断指标。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康雄性12 周龄，体质量250～290 g（北京维通利华实验动物有限公司提供）的自发性高血压大鼠（SHR 大鼠）36 只、Wistar-Kyoto 大鼠（WKY 大鼠）12 只。采用随机数字表法将36 只SHR 大鼠分为对照组（DC 组，n=12）、手术组（术后1 周为DO1组，n=6；术后6 周为DO6，n=6）、假手术组（术后1 周为DS1组，n=6；术后6 周为DS6，n=6）。WKY 大鼠为正常对照组（NC 组，n=12）。保持湿度在40%～70%，控制温度22～24℃。所有大鼠手术或假手术前禁食8 h。处死动物后分别采血，取肾脏及下丘脑组织待检测。所有动物手术操作方法均遵守动物伦理委员会规程。

1.2 RDN 及假手术 用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，后铺巾消毒。分离出肾脏动静脉，在×25 的解剖显微镜下找出肾神经，用蘸取溶于无水乙醇的10%苯酚溶液的棉球反复涂擦肾动脉，持续2～3 min，采用肾神经电刺激的方法评估去肾神经支配是否彻底，其余过程参考文献［5］。假手术组用生理盐水涂抹肾动脉周围，此过程避免损伤神经。其余过程同前。

1.3 标本采集及保存 大鼠智能无创血压计tailcuff 法测量大鼠血压、心率。用无创血压计的尾部气囊套在大鼠尾根部的近心端，充分扩张鼠尾血管，待收集脉搏信号出现规则波形后，充气加压至脉搏信号成为一条直线，然后放气减压，读出并记录收缩压、舒张压及心率数值，每只大鼠测量3 次血压，取3 次测量的平均值。之后下腔静脉采血、离心，将血浆和血清收集至EP 管中，于-80℃冰箱冷冻保存，用于血浆神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、S100B 浓度的测定。采血后迅速摘取右侧肾脏及下丘脑室旁核组织，组织处理好后于-80℃冰箱冷冻保存，用于后续检测。

1.4 检测血浆中NSE、S100B,肾脏NE 以及下丘脑AngII 含量 采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测静脉血中NSE 含量，按照ELISA 试剂盒说明进行。

1.5 检测下丘脑AT1R mRNA 的含量 目的基因引物由上海生工使用Beacon Designer7 软件设计合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。AT1R 正向：5′-AAGAATCCAAGATGACTGCCC-3′，AT1R 反向：5′-TCCCACCACAAAGATGATGCTG-3′；GAPDH正向：5′- GTTACCAGGGCTGCCTTCTC -3′，反向：5′-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。将各样品cDNA稀释10 倍后取2 μL 作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。在60～95℃进行溶解曲线分析。用ABI 7900 Real-Time PCR system 软件处理数据，计算最低循环数Ct 值。采用2-△△ct法计算出各样品的目的基因相对定量结果。

1.6 统计学方法 本研究数据采用SPSS22.0 统计软件进行统计学分析；计量资料用均数±标准差（±s）表示。两组间均数比较用t 检验；多组间均数比较釆用单因素方差分析；变量间的相关性用直线相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠基础数据的比较 DC 组与NC 组、DO1组与DS1组、DO6组与DS6组心率、体质量比较差异无统计学意义（均P＞0.05）；DC 组大鼠收缩压（SBP）、舒张压（DBP）明显高于NC 组；DO1组SBP、DBP 较DC 组 分 别 降 低39.8 mmHg、30.8 mmHg（P ＜0.05）；DO1组SBP、DBP 较DS1组 分 别 降 低38.8 mmHg、29.1 mmHg（P＜0.05），见表1，DO6与DO1组相比SBP、DBP 有所上升，分别上升38.6 mmHg、28.7 mmHg（P＜0.05）。DS6与DS1组相比SBP、DBP有所上升，但是差异没有统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 各组大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)含量 DC 组的NE 含量明显高于NC 组（P＜0.05），DO1组低于DC（P＜0.05）及DS1组（均P＜0.05），DO6组明显低于DS6组（P＜0.05），DO6组较DO1组有明显的升高（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠心率、体质量、血压的比较(±s)Tab 1 Comparison of heart rate,body weight,and blood pressure of rats(±s)

注：NC 组：自发性高血压大鼠；DC 组：去肾交感神经术组；RDN 组：去肾交感神经组；DO1：RDN 1 周组；DO6：RDN 6 周组；DS1：假手术组；DS6：假手术6 周组

RDN 组 假手术组DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）体质量/g 256.60±12.31 258.20±11.66 263.20±10.74 329.00±9.65 263.50±11.78 331.10±8.45心率/(bpm) 419±11 418±12 421±9 416±7 419±13 418±12 SBP/mmHg 138.30±10.48 197.80±7.28# 158.00±10.45a 196.60±5.96 196.80±10.3b 205.3±5.90 DBP/mmHg 80.00±10.77 148.30±6.40# 117.50±5.35 146.20±6.74 146.60±6.76 154.20±6.06组别 NC 组（n=12） DC 组（n=12）

表2 各组大鼠NE 的比较(±s)Tab 2 Comparison of NE in each group of rats(±s)

表2 各组大鼠NE 的比较(±s)Tab 2 Comparison of NE in each group of rats(±s)

注：DC 组与NC 组比较，aP＜0.05；DO1 组与DC 组比较，bP＜0.05；DO1 组与DS1 组比较，cP＜0.05；DO6 组与DS6 组比较，dP＜0.05

RDN 组 假手术组DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）NE/（pg/mL） 92.9±5.70 209.2±8.12a 189.7±7.81b 217.8±2.09 229.1±5.85c 276.6±8.35d组别 NC 组（n=12） DC 组（n=12）

2.3 下丘脑血管紧张素II(AngII)、AT1R mRNA 含量的变化 DO1组AngII、AT1R mRNA 明显低于DC组、DS1（均P＜0.05），DO6组明显低于DS6组（P＜0.05），DO6组高于DO1组（P＜0.05）。DC 组下丘脑AT1R mRNA 表达较NC 组明显升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠下丘脑AT1R mRNA、AngⅡ表达的比较(±s)Tab 3 Comparison of AT1R mRNA and AngⅡexpression in the hypothalamus(±s)

表3 各组大鼠下丘脑AT1R mRNA、AngⅡ表达的比较(±s)Tab 3 Comparison of AT1R mRNA and AngⅡexpression in the hypothalamus(±s)

注：DO1 组与DC 组、DS1 组和DO6 组相比，均P＜0.05；DO6 组与DS6 组相比，P＜0.05

RDN 组 假手术组DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）AT1R mRNA/（pg/mL） 0.56±0.02 1.03±0.03 0.74±0.04 1.08±0.06 1.17±0.06 2.01±0.05 ANGII/（pg/mL） 20.38±1.58 40.71±1.78 34.39±2.17 42.12±1.25 44.41±1.05 60.34±1.37组别 NC 组（n=12） DC 组（n=12）

2.4 各组大鼠血浆NSE、S100B 含量变化 DO1组大鼠NSE 及S100B 较DC 组及DS1组明显升高（均P＜0.05）；DO6组血浆NSE 及S100B 与SHR 基线组及DS6组比较无统计学差异（均P＞0.05），DC 组血浆NSE 及S100B 水平明显高于NC 组（P＜0.05）；DO6组较DO1组NSE 及S100b 含量有所回升（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠血浆NSE 及S100B 比较(±s)Tab 4 Comparison of plasma NSE and S100B of rats(±s)

表4 各组大鼠血浆NSE 及S100B 比较(±s)Tab 4 Comparison of plasma NSE and S100B of rats(±s)

注：DC 组与NC 组比较，aP＜0.05；DO1 组与DC 组比较，bP＜0.05；DO1 组与DS1 组比较，cP＜0.05

RDN 组 假手术组DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）NSE/（ng/mL） 7.30±0.69 9.36±0.84a 13.96±0.72bc 11.31±0.29 9.44±0.27 10.19±0.88 S100B/（ng/mL） 0.59±0.07 0.84±0.02a 1.30±0.17bc 0.91±0.08 0.85±0.04 0.86±0.06组别 NC 组（n=12） DC 组（n=12）

2.5 血浆NSE、S100B 与肾脏NE 的相关性分析 直线相关分析示:SHR 大鼠血浆NSE 与肾脏NE 呈负相关(rs=-0.82，P＜0.01)；血浆S100B 与肾脏NE 亦呈负相关(rs=-0.934，P＜0.01)。

3 讨论

2019 年公布的一项数据分析表明RDN 可以显着降低患者收缩压、舒张压及24 h 动态血压［7］。但RDN 的具体降压作用机制不甚明了。本研究组采用化学消融的方式损伤大鼠肾脏交感神经，希望通过对中枢AT1mRNA、AngⅡ表达的监测以说明RDN术对于机体的中枢水平也有降低血压的作用。

本实验通过对大鼠血浆NE 在RDN 前后含量的变化的观察，发现RDN 术后（DO1组）大鼠的血浆NE 含量下降明显。而NE 是由肾交感神经释放的，是反映肾交感神经活性的最直观的指标。肾交感神经在高血压的发病机制中起着十分重要的作用，其过度激活已经被认为是高血压发生和发展的重要机制之一，肾交感神经作为抑制交感神经的过度激活为治疗高血压的落脚点，越来越得到大家的青睐。肾交感神经不仅支配肾血管，还支配肾小管上皮的细胞和近球小体，通过释放NE，作用于肾脏表面的α 受体，从而引起肾血流量减少，肾小球滤过率下降；当其作用于近球细胞的β 受体，近球小体就会释放肾素，血循环中的AngII 和醛固酮增加，肾小管重吸收Na+增加，这在血容量增大导致的高血压中发挥关键作用［8］。AngII 和AT1R 是RAAS 的重要组分。近年来发现中枢神经中也有RAAS 各种组成成分。而本实验中，RDN 组中DO1组与假手术组及DC 组相比下丘脑AngII、AT1R mRNA 明显降低。Masaaki等［10］通过实验发现，进行过RDN 的CKD 小鼠 的 下丘脑室旁核（raraventricular nucleus，PVN）获得的输入信号减少，肾交感神经活性（renalsympathetic nerve activity，SNA）随之减低，小鼠的收缩压/舒张压明显减低［9］。表明RDN 可能通过减少传入PVN 的冲动，从而减弱PVN 对SNA、AngII 产生的影响，降低下丘脑中AngII 及AT1R 的水平，从而降低高血压患者血压水平［10］。由于心率对于血压影响较大，Qiu 等［11］的实验也表明进行过RDN 的鼠24 h 动态血压与心率没有明显的关系，表明RDN 降低血压不是依赖于降低心率。

本实验中NSE 是一种神经元和神经内分泌细胞所特有的酸性蛋白酶，是神经细胞分化成熟或损伤的标志，其含量与神经细胞损伤相关。国内已有江凤林等［12］对高血压犬行RDN 术，观察到犬血浆NSE 水平显著升高，血压显著而持久的下降［13］。而本研究也得到了相似的结果。表明血浆中NSE 含量变化可能与肾交感神经元破坏的程度有关。而本研究中检测的另外一个指标S100B 蛋白，是外周神经组成部分之一施万细胞（schwann，又名雪旺细胞）的标志蛋白。施万细胞作为一种神经胶质细胞，能分泌神经营养因子，促进受损神经元的修复及轴突的再生。S100B 在血浆中含量的多少则反映施万细胞破坏的程度。在脑卒中领域，NSE 和S100B 往往被认为是反映中枢神经损伤的生物标志物［14］。本实验中DO1组S100B 较DC 组、NC 组明显升高。说明S100B 也能在一定程度上反映肾交感神经损伤的程度。

本实验结果还能发现D06组AngII、NE 较DO1组有所升高；NSE、S100B 较DO1组有明显的回落。究其原因，可能为实验操作时，肉眼识别的交感神经数目有限，没能将肾交感神经消融完全。所以在消融了一部分神经后，引起了NE、AngII 的降低，NSE、S100B 也因为化学消融损伤了细胞所以有一过性升高。但在这之后，也就是肾交感神经代偿性的生长后，NE、AngII 又出现了升高。而血浆中NSE、S100B随着机体代谢，含量变少，仅残存机体里的是仍旧未代谢完的。

从本研究的结果可以看出：（1）RDN 可显著性降低血压，并不依赖于心率的降低；（2）RDN 可显著的降低肾脏NE 水平；（3）RDN 可降低下丘脑AT1R mRNA、AngII 的表达。因此，笔者推测RDN 可通过降低下丘脑AngII、AT1R 水平，以及降低外周交感神经活性，即降低肾脏NE 水平，降低血压。

另外，本次研究存在一些局限性，包括：（1）未能通过油红染色等直观的实验方法反映肾脏交感神经细胞及肾动脉的RDN 前后对比；（2）观察时间不够长，因此不能评估RDN 对于高血压动物的更长远影响；（3）对大鼠的肾动脉交感神经消融不完全。

综合上述结果可以推测：第一，RDN 可能是通过下调下丘脑AngII 和AT1R mRNA 的表达降低交感神经活性，从而降低血压。此结果在本研究组RDN对心力衰竭的相关研究中也得到了证实。第二，NSE、S100B 水平或许可作为判断RDN 治疗成功与否的标志。第三，RDN 后，动物的肾交感神经消融得不够彻底时，可能在一段时间后，肾交感神经会发生代偿生长。