TNF-α 诱导的circMAN1A2 促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖

白丽丽,汤华

（天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津市生命科学中心实验室，天津市炎症生物学重点实验室，天津300070）

宫颈癌（cervical cancer，CC）作为最常见的妇科癌症，具有很高的发病率和死亡率，在全世界由癌症导致的死亡病例中位于第四位［1］。每年全球大约有50 万名女性被确诊为宫颈癌，其中因为宫颈癌而死亡的人数更是远远超过了30 万人［2］。科学证据清楚地表明，宫颈癌是由人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）某些基因型的持续感染引起的［3］。因此，近年来细胞学和/或HPV 筛查计划成为预防宫颈癌的有效措施［4］，外科手术结合放疗和化疗是治疗和增加宫颈癌患者生存时间的主要策略［5］。然而，由于肿瘤的复发和转移，宫颈癌患者的预后常常不如预期所料［6］。因此，深入研究宫颈癌发生的分子机制对开发新的癌症相关生物标志物以及寻找新的治疗方法都是至关重要的。

环状RNA（circRNA）是一种非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），也是近年来RNA 领域的研究热点。CircRNA 不像线性RNA 那样具有5′端帽结构和3′端多聚体（A）尾，而是形成了具有共价键的封闭环状结构［7］。环状RNA 不受RNA 核酸外切酶的影响，所以它的表达更稳定［8］。这些特性使得环状RNA 在作为新的临床诊断标志物的开发和应用中具有明显的优势。近来大量研究表明，circRNA 在许多生物过程中发挥重要作用［9］。在由特定蛋白质复合物和互补RNA 元件调节的反向剪接后，circRNA可通过与miRNA 或RNA 结合蛋白相互作用参与肿瘤进展［7，10-11］。越来越多的研究表明，circRNA 可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）而发挥作用。例如：circRNA cTFRC 可以通过充当microRNA-107 的海绵，调节TFRC 的表达进而促进膀胱癌的进展［12］。

研究表明circMAN1A2 在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌和肺癌中表达上调，可能作为这些疾病的血清学标志物，但其作用机制目前仍不明了［13］。在本研究中，通过RNA 高通量测序的方法发现TNF-α处理后HeLa 细胞中circMAN1A2 表达水平升高。过表达circMAN1A2 可以促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。表明其在宫颈癌的诊断和治疗中可能具有重要的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料 宫颈癌HeLa 和SiHa 细胞（ATCC，美国），RPMI 1640 液体培养基，DMEM 液体培养基（GIBCO，美国），细胞培养箱（Thermo Fisher，美国），胎牛血清（FBS;GIBCO，美国），TNF-α（碧云天生物科技有限公司，中国），RNase R（广州吉赛生物科技有限公司，中国），RNA 分离试剂盒（Active motif，美国），MTT（SIGMA-Aldrich，美国），LipofectamineTM 2000 regent（Invitrogen，美国）

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈癌细胞系HeLa 和SiHa细胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培养基中培养，将细胞孵育在37 ℃含5%CO2的培养箱中，待细胞汇合度达到80%～90%时进行传代培养。

1.2.2 TNF-α 加药处理 将HeLa 细胞接种至两个100 mL 细胞培养瓶。40 h 后取出其中一瓶标记为“TNF-α 组”，弃去原培养液，加入8 mL 含60 ng/mL TNF-α 的培养液，另一瓶标记为“无处理组”，加入等体积的细胞培养液。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR） 使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，中国）进行RT-qPCR 以检测RNA 的表达水平。β-actin 作为内源性对照。RT-qPCR 的所有引物如表1 所示。

1.2.4 CircMAN1A2 过表达及敲降 质粒均由上海通用生物有限公司合成。

1.2.5 RNase R 耐受性 将HeLa 细胞接种到100 mL细胞培养瓶内，48 h 后提取宫颈癌细胞总RNA。用12 IU/μL RNaseR 处 理 后，通 过RT-qPCR 检 测circMAN1A2 和lineMAN1A2 的表达水平。

表1 各基因引物序列Tab 1 Sequence of each gene primer

1.2.6 核质RNA 分离 按照Active motif 说明书步骤进行核质RNA 分离。

1.2.7 Transwell 迁移/侵袭 转染24 h 后，1×PBS洗涤细胞，重悬于无血清培养基中并接种到不含/含Matrigel 的transwell 上层小室进行迁移（6×104细胞）/侵袭（8×104细胞）实验。下室加入600 μL 含有20%FBS 的细胞培养基。温育48 h 或72 h，将迁移/侵袭的细胞用固定液（75%甲醇-25%冰醋酸）固定并用结晶紫染色。在100 倍放大倍数下随机选取5个视野，并在Nikon TE2000 显微镜下对迁移/侵袭的细胞计数。

1.2.8 MTT 转染 24 h 后，以4000/孔的密度将细胞接种到96 孔板。分别在24 h、48 h 和72 h 加入10 μL MTT，继续培养4～6 h。避光弃去原含MTT 的培养液，加入100 μL DMSO，避光摇晃5 min，使甲瓒充分溶解。测定OD490 波长处的吸光度值。

1.2.9 集落形成 转染24 h 后，以500/孔的密度将细胞接种到12 孔板。每3 d 更换1 次新鲜培养液，持续两周。用结晶紫染色，然后计算相对细胞集落形成率。

1.3 统计学处理 所有作图软件均为GraphPad Prism 6.0。两组间均数比较采用t 检验方法进行处理。所有数据结果均代表3 次重复试验的平均值。以P ＜0.05 作为有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 TNF-α 促 进HeLa 细 胞 中circMAN1A2 表达 TNF-α 处理后的RNA 高通量测序分析共检测到98 种表达上调和63 种表达下调的circRNA。其中表达上调的circMAN1A2 来源于MAN1A2 母基因，位于1 号染色体第117402186-117405645 碱基。经RT-qPCR 验证得知circMAN1A2 表达水平确实升高（P＜0.001，图1A）。RNase R 耐受性实验结果表明相比于线性MAN1A2（lineMAN1A2），circMAN1A2更能够耐受RNase R 消化（P＜0.05，P＜0.001，图1B）。核质RNA 分离实验表明circMAN1A2 主要定位于细胞核中（P＜0.001，图1C）。

图1 TNF-α 促进HeLa 细胞中circMAN1A2 表达Fig 1 TNF-α promotes the expression of circMAN1A2 in HeLa cells

2.2 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞迁移能力 为了研究circMAN1A2 对宫颈癌细胞恶性行为的影响，构建circMAN1A2 过表达及敲降质粒，并用RTqPCR 检测质粒有效性。结果表明转入circMAN1A2过表达质粒后circMAN1A2 表达水平升高，line-MAN1A2 表达水平没有明显变化；转入circ-MAN1A2 敲降质粒后circMAN1A2 表达水平降低，lineMAN1A2 表达水平没有明显变化，表明构建的质粒只影响环状RNA 表达水平而不影响线性RNA表达（P＜0.01，图2A）。细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某种物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移是正常细胞的功能之一，并且与癌症转移密切相关，因此利用transwell 迁移实验来研究circMAN1A2 对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果发现：过表达circMAN1A2 促进宫颈癌细胞迁移能力，敲降circMAN1A2 抑制宫颈癌细胞迁移能力（P＜0.05，P＜0.001，图2B；P＜0.01，P＜0.001，图2C）。

图2 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞迁移Fig 2 CircMAN1A2 promotes the migration of cervical cancer cell

2.3 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞侵袭能力 癌细胞侵袭是指肿瘤细胞向局部侵犯或远处转移的能力。癌细胞的侵袭转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是影响患者预后的主要因素。因此利用transwell 侵袭实验来研究circMAN1A2 对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果发现：过表达circMAN1A2 促进宫颈癌细胞侵袭能力，敲降circMAN1A2 抑制宫颈癌细胞侵袭能力（P＜0.01，图3A；P＜0.01，P＜0.001，图3B）。

图3 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞侵袭Fig 3 CircMAN1A2 promotes the invasion of cervical cancer cell

2.4 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞活性 细胞活性是指细胞的生理状态和功能。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶性甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。因此利用MTT实验来研究circMAN1A2 对肿瘤细胞活性的影响。过表达circMAN1A2 促进宫颈癌细胞活性，敲降circMAN1A2 抑制宫颈癌细胞活性（P＜0.01，P＜0.001，图4A；P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，图4B）。

图4 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞活性Fig 4 CircMAN1A2 promotes the viability of cervical cancer cell

2.5 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞体外增殖能力 单个细胞在体外持续增殖6 代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落。因此集落形成实验是检测细胞增殖能力的有效方法之一。过表达circMAN1A2促进宫颈癌细胞体外增殖能力，敲降circMAN1A2抑制宫颈癌细胞体外增殖能力（P＜0.001，图5A；P＜0.001，图5B）。

图5 CircMAN1A2 促进宫颈癌细胞体外增殖能力Fig 5 CircMAN1A2 promotes the proliferation of cervical cancer cells in vitro

3 讨论

研究表明，宫颈癌是由HPV 某些基因型的持续感染引起的。而炎性细胞因子TNF-α 诱导的核因子-κB 活化是炎症导致癌症的常见机制。研究表明TNF-α 诱导的慢性炎症能够增加细胞的易感性并导致恶性肿瘤的进展［14-15］。在慢性炎症转化为癌症的发生、发展过程中发现了很多miRNA，如miR-10a、miR-320a、miR-495 等与结肠癌或胃癌的进展有关［16-18］。笔者实验室之前已经发现一些miRNA 受核因子-κB 转录调控，其中miR-23a 和miR-429 分别通过靶向核因子-κB 抑制蛋白激酶（IKK）α 和IKKβ 形成了反馈调节环［19-20］。但是，与慢性炎症转化为癌症相关的circRNA 的研究却几乎没有。因此，对这类circRNA 的研究将为宫颈癌的诊断和治疗提供新的临床依据。

近年来，大量研究表明，circRNA 与多种人类疾病的发生、发展密切相关，在几种人类癌症中充当必需的调节剂。已经发现许多circRNA 在宫颈癌中异常表达。例如，通过生物信息学分析发现，与正常组织相比，hsa_circRNA_101996 在宫颈癌组织中高表达，较高水平的hsa_circRNA_101996 与宫颈癌患者的预后不良有关，机制上，hsa_circRNA_101996通过miR-8075/TPX2 途径抑制了宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭［21］。此外，hsa_circ_0000263 可通过影响miR-150-5p 调节MDM4 的表达促进肿瘤细胞增殖和迁移能力［22］。过表达的circ_0067934 可以通过miR-545/EIF3C 轴促进宫颈癌进展［23］。

本文研究结果表明，炎性细胞因子TNF-α 促进circMAN1A2 的表达，过表达circMAN1A2 促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖。提示circMAN1A2 可能参与宫颈癌的发生、发展，并且可能为宫颈癌的诊断治疗和预后提供新的思路。