三氧化二砷通过抑制血管内皮生长因子 mRNA表达抗骨髓增生异常综合征血管新生作用的初步研究

石秋杰 罗琼 尤学芬

[摘要] 目的 探討三氧化二砷通过下调人脐静脉内皮细胞和SKM-1人骨髓增生异常综合征细胞株（SKM-1细胞株）的血管内皮细胞生长因子mRNA表达，具有抗骨髓增生异常综合征血管新生作用。方法 采用逆转录-聚合酶链反应扩增血管内皮细胞生长因子的方法。观察：①不同浓度As2O3对A组（人脐静脉内皮细胞）、B组（经SKM-1细胞株上清液干预人脐静脉内皮细胞）及C组（SKM-1细胞株）血管内皮生长因子 mRNA的影响。②相同浓度下，三氧化二砷分别干预A、B及C 3组12、24、36、48、60、72 h后，其对血管内皮生长因子mRNA的影响。结果 ①随着三氧化二砷作用浓度的增加，A、B、C 3组血管内皮生长因子 mRNA表达显著下降，并呈负性相关关系（t=8.636、2.560、13.002，P<0.001）;②随着三氧化二砷作用浓度和时间的增加，A、B及C 3组的血管内皮生长因子 mRNA表达均逐渐下降，呈显著的负性相关关系（P<0.05）;③对A、B组表达结果进行比较B组血管内皮生长因子mRNA表达高于A组，差异有统计学意义（t=3.400，P<0.05）。结论 三氧化二砷可通过下调人脐静脉内皮细胞和SKM-1细胞株的血管内皮生长因子转录和翻译过程而实现抗血管新生作用，提示骨髓增生异常综合征细胞可能分泌上调血管内皮细胞中血管内皮生长因子基因表达的物质，具有促进血管新生作用。

[关键词] 三氧化二砷;人脐静脉内皮细胞;血管内皮生长因子;SKM-1细胞株

[Abstract] Objective To investigate the role of arsenic trioxide in down-regulating the expression of vascular endothelial cell growth factor mRNA in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 human myelodysplastic syndrome cell line （SKM-1 cell line）， and have anti-myelodysplastic syndrome blood vessels rejuvenation. Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to amplify vascular endothelial cell growth factor. Observation 1.Different concentrations of As2O3 on vascular endothelial growth factor mRNA in group A （human umbilical vein endothelial cells）， group B （intervention of human umbilical vein endothelial cells via the supernatant of SKM-1 cell line） and group C （SKM-1 cell line） impact. 2.At the same concentration， the effects of arsenic trioxide on the vascular endothelial growth factor mRNA in groups A， B and C after 12 h， 24 h， 36 h， 48 h， 60 h， and 72 h， respectively. Results 1.With the increase of the concentration of arsenic trioxide， the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A， B， and C decreased significantly and showed a negative correlation （t=8.636， 2.560， 13.002， P<0.001）; 2.As the concentration and time of arsenic trioxide increased， the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A， B and C gradually decreased， showing a significant negative correlation （P<0.05）; 3.Comparison of the expression results in groups A and B B The expression of vascular endothelial growth factor mRNA in group was higher than that in group A， and there was a statistical difference （t=3.400， P<0.05）. Conclusion Arsenic trioxide can achieve anti-angiogenesis by down-regulating the transcription and translation of vascular endothelial growth factor in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 cell lines，and to suggest that myelodysplastic syndrome cells may secrete up-regulation of blood vessels in vascular endothelial cells endothelial growth factor gene expression substance has the role of promoting angiogenesis.

[Key words] Arsenic trioxide; Human umbilical vein endothelial cells; Vascular endothelial growth factor; SKM-1 cell line

大量研究表明，肿瘤的发生和发展伴有血管新生，多种血液系统恶性肿瘤同样存在血管新生。骨髓增生异常综合征（骨髓增生）是造血干细胞异质性的克隆性疾病，在疾病的发展过程中有一部分会进展为急性白血病，曾有研究表明骨髓增生存在血管新生，同时与疾病进展和转化有密切关系[1]。血管新生对造血微环境的影响以及在肿瘤发生发展中的作用成为近年来研究的热点。研究发现肿瘤细胞可通过自主分泌生长因子来刺激内皮细胞迁移和毛细血管的增生。在多种参与肿瘤血管形成的细胞因子中，血管内皮细胞因子（VEGF）是作用最强、特异性最高的促血管新生因子，在肿瘤的血管形成中起关键作用[2]。然而近年来As2O3在基础研究及临床应用中均显示出较广谱的抗肿瘤效应[3]。它作为一种新兴的肿瘤血管生成抑制剂，其作用机制尚不明确。血管内皮细胞作为血管新生的靶细胞，该研究通过体外实验检测三氧化二砷对血管内皮细胞株和骨髓增生细胞株的生长抑制及VEGF基因表达的变化，进一步探讨三氧化二砷的抗血管新生機制，现报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料与分组

1.1.1  细胞株及实验分组  该实验研究对象为人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）和SKM-1细胞株。HUVEC购自武汉典型生物保藏中心（CCTCC），SKM-1购自日本JCRB细胞库。

1.1.2  实验分组  ①A组：血管内皮细胞株（HUVEC）;②B组：血管内皮细胞株（HUVEC）与SKM-1细胞株上清液共同孵育;③C组：SKM-1细胞株。

1.1.3  细胞株培养  细胞株的培养和传代 ①HUVCE细胞（A组）：HUVCE细胞以2×105个细胞/mL的终浓度接种于培养瓶，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，总体积10 mL。②B组细胞：A组细胞以2×105个细胞/mL的终浓度接种于培养瓶，培养于含10%胎牛血清、30%SKM-1细胞培养上清夜的RPMI 1640培养液中，总体积10 mL。A、B组细胞均置于37℃，5%CO2，饱和湿度下培养3 d至对数生长期，留取标本备用。③SKM-1细胞（C组）：取对数生长期SKM-1细胞，新鲜培养液洗涤后，重悬于含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，以2×105个细胞/mL的终浓度接种于培养瓶，总体积10 mL。置于37℃，5% CO2，饱和湿度下培养3～4 d至对数生长期，留取标本备用。

1.2  研究方法

利用GenBank数据库中提供的VEGF、β-actin mRNA序列，经计算机引物设计网站设计引物，再经GenBank BLAST进行同源性检测，由上海生物工程有限公司合成两对引物，序列如下。

1.3  RT-PCR法半定量检测法

①A、B和C组细胞在不同终浓度的As2O3条件下培养1 d，用RT-PCR法半定量检测VEGF mRNA的表达变化。

②A、B、C组细胞株细胞在As2O3终浓度为12 μmol/L条件下培养12、24、36、48、60、72 h，用RT-PCR法半定量检测各组各时间段VEGF mRNA的表达变化。

1.4  统计方法

采用Stata 7.0统计学软件进行数据分析。RT-PCR法半定量结果分析：直线相关分析药物浓度-时间与VEGF表达强度的相关性;A组与B组均数比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  As2O3不同浓度处理后细胞VEGF基因的表达

①HUVEC和SKM-1细胞株均表达VEGF mRNA ;②随着As2O3作用浓度的增加，A、B、C 3组VEGF mRNA表达显著下降，并呈负性相关关系;③取As2O3不同浓度处理A、B、C 3组，对A、B组表达结果进行比较。统计结果示HUVEC中加入骨髓增生上清液后VEGF mRNA表达高于未加组，差异有统计学意义（t=3.400，P<0.05）。提示骨髓增生细胞可分泌上调血管内皮细胞中VEGF基因表达的物质，见表1、2。

2.2  As2O3不同时间处理后细胞VEGF基因的表达

As2O3作用时间的增加，A、B、C 3组VEGF mRNA表达也显著下降， 并呈负性相关关系，见表3、4。

3  讨论

研究发现不同病期的骨髓增生患者骨髓微血管密度均高于正常对照组，存在血管新生现象[4]。抗血管新生治疗在恶性血液病治疗过程中其疗效高于常规治疗组，具有较好的临床效果[5]。近年来有学者注意到三氧化二砷作用机制复杂，能通过抗肿瘤血管新生，抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制VEGF合成、抑制肿瘤细胞增殖和侵袭等多种机制起到抗肿瘤作用[6-7]。在骨髓增生的治疗中，As2O3与HAG的治疗效果相近，且不良反应较少[8]，同时As2O3联合其他方案治疗效果均优于单纯标准方案，且不良反应较少[9-11]。三氧化二砷通过抑制肿瘤血管形成而影响肿瘤细胞的生长，但确切机制尚不清楚，该课题研究三氧化二砷对内皮细胞增殖及血管生成基因表达等方面的影响，探讨其抗血管新生的作用机制。

VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，其在生理及病理状态血管形成过程中发挥了关键性作用[12]。在恶性血液病患者临床辅助诊断及预后评估中具有一定的应用价值[13]。VEGF与白血病的发生发展密切相关，可通过促进微血管的增生来调控白血病细胞的增殖分化，抑制VEGF 与其受体VEGFR 结合，从而阻止白血病细胞生长及血管生成，达到预防及治疗白血病的目的[14]。

该研究应用RT-PCR半定量法检测表明，HUVEC和SKM-1细胞株均表达VEGF mRNA。随着As2O3作用浓度和时间的增加，HUVEC、SKM-1及SKM-1培养的HUVEC细胞株中VEGF mRNA表达逐渐下降;3组表达均与浓度、时间呈显著的负性相关关系。因此，As2O3可同时通过下调HUVEC和SKM-1细胞株中VEGF mRNA表达而实现抗血管新生作用。与Kimura[15]研究显示As2O3可下调细胞血管内皮生长因子表达相关转录因子HIF-1的活性，从而使肿瘤细胞VEGF的表达下降，结论一致。与相关研究[2]显示高浓度As2O3可显著抑制HUVEC增殖，且抑制作用具有时间及剂量依赖性（P<0.05），结论一致。同时发现SKM-1培养的HUVEC细胞株VEGF mRNA的表达高于HUVEC细胞株，提示骨髓增生细胞能分泌上调血管内皮细胞VEGF基因表达的细胞因子。根据罗琼等人[16]的研究结果显示，骨髓增生患者骨髓微血管密度（MVD）显著高于正常对照组（P<0.01），随着病程的进展患者的MVD呈增高趋势（Rs=0.861 3，P<0.05）;②As2O3對HUVEC及SKM-1细胞株干预组的作用均表现时间、剂量依赖性的增殖抑制效应（F=10.92，P<0.05）;③HUVEC中加入SKM-1上清液共同培养对促进细胞生长有明显作用（P<0.01）。

综上所述，As2O3通过抑制血管内皮细胞生长，下调HUVEC和SKM-1细胞株中VEGF表达而减少VEGF产量，从而具有抗血管新生作用。

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（收稿日期：2020-12-04）