湖北土家族人群24个常染色体短串联重复基因座的遗传多态性*

刘亚举，岳俊涛，李 瑾，李学博，石美森

1.河南省许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌 461000；2.山东省高校证据鉴识重点实验室(山东政法学院)，山东济南 250014；3.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京 100192

短串联重复(STR)基因座是法医学常用遗传标记，因其主要表现为长度多态性，结合毛细管电泳技术可快速完成基因的检测，已成为法医学检验中DNA分型技术的主流遗传标记及主要检测技术[1]，广泛应用于法医学个体识别和亲缘关系鉴定[2-4]。本研究通过对SureID®PanGlobal试剂盒中所包含的24个常染色体STR基因座在湖北土家族人群中的分布频率和群体遗传学参数进行调查，并收集了全国其他多民族群体的相关数据，进行了人群间遗传距离和遗传关系的推断，为该民族个体识别和亲权鉴定、群体间遗传分布等相关研究提供参考数据。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据知情同意原则，从体检健康人群中随机采集湖北土家族人群457例(男394例，女63例)无血缘关系个体外周血0.1 mL，滴入采血卡(武汉骥腾公司)，阴干后常温保存。该研究得到汕头大学医学院伦理委员会批准。

通过中国知网(www.cnki.net)和NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获得10个汉族人群[北京(369例)、辽宁(342例)、河南(1 136例)、山东(1 030例)、山西(554例)、湖北(3 078例)、湖南(560例)、广东(1 533例)、福建(741例)、贵州(605例)]以及10个少数民族人群[内蒙古蒙古族(135例)、甘肃东乡族(511例)、甘肃回族(1 038例)、甘肃裕固族(174例)、西藏藏族(203例)、新疆喀什维吾尔族(1 381例)、新疆和田哈萨克族(1 130例)、云南苗族(748例)、海南黎族(189例)、湖南沅陵土家族(510例)]共20个人群的STR基因座等位基因频率作为群体遗传关系比较的数据。每人群至少含有18个STR基因座资料、样本量至少有100例。

1.2仪器与试剂 Hamilton STAR-LET自动化工作站(AusBio公司，瑞士)；平板离心机(Eppendorf公司，德国)；Mastercycler pro S银座PCR扩增仪(Eppendorf公司，德国)；3500XL型遗传分析仪和ID-X分析软件(ThermoFisher公司，美国)；GeneMarker®HID分析软件(SoftGenetics公司，美国)。SureID®PanGlobal试剂盒和内标SIZE-500 Plus(宁波海尔施基因科技有限公司)，阳性标准品9947A(ThermoFisher公司，美国)。

1.3方法 根据SureID®PanGlobal荧光检测试剂盒说明书，用直扩法(免提取)对前述血液标本进行PCR扩增。在Mastercycler pro S银座PCR扩增仪上进行复合扩增，反应体系为10 μL，其中PCR Master Mix 5.0 μL、Primer Mix 2.5 μL、纯水2.5 μL和1.2 mm直径血卡。热循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，61 ℃ 1 min，70 ℃ 30 s，28个循环；60 ℃ 15 min；4 ℃保温。取1 μL扩增产物与0.5 μL内标SIZE-500 Plus和8.5 μL去离子甲酰胺混合，95 ℃变性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遗传分析仪上进行全自动毛细管电泳，Data Collection软件收集数据，用GeneMarker®HID分析软件进行等位基因分型，并采用GeneMapper ID-X v1.5分析软件复核分析。每批标本检测均采用9947A和超纯水分别作为阳性对照和阴性对照。

1.4统计学处理 用PowerMarker®v3.25软件获得各STR基因座的等位基因频率及法医学相关参数[杂合度(H)、个人识别概率(DP)、多态性信息含量(PIC)]；采用PowerStats v12软件计算三联体非父排除率(PEtrios)和二联体非父排除率(PEduos)。采用Arlequin v3.5 软件(http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3.5)进行各基因座Hardy-Weinberg平衡及连锁不平衡检验。应用DISPAN软件(http://www.personal.psu.edu/nxm2/software.htm)计算21个群体Nei′s DA 遗传距离矩阵(Rst值)，Mega 6.0软件(http://www.megasoftware.net/)构建21个群体邻接(NJ)系统发生树和UPGMA聚类分析。

2 结 果

2.1湖北土家族人群24个STR和1个Y-indel基因座遗传多态性 在457例湖北土家族无关个体血液标本中，SureID®PanGlobal荧光检测试剂盒中的24个STR和1个Y-indel、DYS391基因座都得到了有效扩增，其中男性标本在Y-indel和DYS391基因座均检测到1个等位基因，性别(Amel)检测结果为XY，而女性标本在Y-indel和DYS391基因座检测结果均为阴性，Amel检测结果为X。各等位基因频率见表1。

2.2湖北土家族人群24个STR基因座的法医遗传学参数 24个STR基因座的基因型频率分布在湖北土家族人群中达到Hardy-Weinberg平衡(PHWE>0.05)，各基因座之间相互独立，属于连锁平衡状态，累积个体识别率(CDP)和累积非父排除率(CPE)分别为1-2.574 0×10-30和1-1.593 9×10-11。24个STR基因座的群体遗传学参数见表2。

2.3湖北土家族与20个人群间的遗传距离 应用本文获得的湖北土家族人群的STR基因座基因频率数据，与20个比较人群的Nei′s DA遗传距离见表3；根据遗传距离，采用邻位相连法构建的21个人群间NJ系统发生树；采用UPGMA法对21个人群进行聚类分析，见图1。

表1 湖北土家族人群24个常染色体STR基因座和1个Y-indel的等位基因频率分布

注:A为等位基因,F为等位基因频率。

表2 湖北土家族人群24个STR基因座的群体遗传学参数

表3 21个人群Nei′s DA遗传距离矩阵

续表3 21个人群Nei′s DA遗传距离矩阵

注：[01]为湖北土家族；[02]为湖南沅陵土家族；[03]为山东汉族；[04]为山西汉族；[05]为湖南汉族；[06]为广东汉族；[07]为湖北汉族；[08]为贵州汉族；[09]为河南汉族；[10]为福建汉族；[11]为北京汉族；[12]为辽宁汉族；[13]为内蒙古蒙古族；[14]为甘肃东乡族；[15]为甘肃回族；[16]为甘肃裕固族；[17]为新疆和田哈萨克族；[18]为新疆喀什维吾尔族；[19]为西藏藏族；[20]为云南苗族；[21]为海南黎族。

图1 21个人群的UPGMA法聚类分析

3 讨 论

人类STR基因座在不同人群中表现出不同的遗传多态性，即具有群体特异性[1]，评价遗传标记STR基因座的遗传多态性常用参数有F、H、DP、PIC和PE，PHWE值均大于0.05，说明所收集的群体数据基因型的预期值和观察值是吻合的，样本收集有效[5]。本研究结果显示，DP为0.797 2～0.991 7，表明随机抽取个体在进行个体识别时匹配可能性较高。PE为0.360 3～0.882 8，表明多态性程度越高排除非亲生父亲的效能越高。DP和PE反映遗传标记系统在个体识别和亲权鉴定中的能力，通常当DP大于0.9、PE大于0.5[6]表明基因座具有高度多态性[1]。本研究的24个STR基因座在湖北土家族人群中的CDP为1-2.574 0×10-30，CPE为1-1.593 9×10-11，远高于判定标准CPE的99.99%，说明此鉴定系统对个体识别和亲权鉴定具有较高的法医学应用价值。

通过计算上述群体的遗传距离，结果显示，同其他人群相比，湖北土家族与云南苗族(0.038 8)遗传距离最远，与湖北汉族(0.002 9)遗传距离最近。NJ系统发生树聚类分析显示，本研究纳入的21个不同地区人群被划分为3个分支，其中湖北土家族和湖北汉族分别单独列为一支，其他汉族群体列为第3个分支。对第3个分支进一步分析，各民族有明确的地域区分。另外，同一民族群体，其群体等位基因频率会随样本容量、地域及环境变化而改变，本研究纳入的21个群体的样本量大小不同，对其采样群体的代表性也不尽相同，大样本量的频率资料更能准确地反映出所在群体的频率分布情况；同时，这些群体分布在我国地理差异较大的地区，受环境因素影响较大；这些差异均可在聚类分支里体现出来。本研究选用D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D12S391、D2S1338、D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSF1PO、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D16S539等16个STR基因座遗传信息是基于参考资料所涉及的基因座不同，采用相同基因座可避免因不同位点造成的统计学误差[7]。从总体来看，根据24个STR基因座计算的遗传距离与各民族群体的形成历史较一致[8]，说明了常染色体STR遗传标记在民族间遗传距离和基因漂流的评价中起到一定作用。

综上所述，根据21个人群的24个STR基因座计算的遗传距离结果与它们的地理分布和民族历史记载基本一致，能够比较全面地反映我国多民族间的遗传关系和近期以来的基因漂流变化。要阐明这些群体间的遗传结构，需要增加研究STR遗传标记，特别是与Y-SNP分型、线粒体DNA结果进行互补[9-11]，才能提高精确性，更加全面地揭示出各个人群的进化历史以及群体间的亲缘关系。