顶空气相色谱法检测羟基甲硝唑对照品中的残留溶剂

马秋冉，杨 星，杨秀玉，张秀英，于晓辉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

甲硝唑是畜牧生产中常用的一种硝基咪唑类药物，此类药物能杀灭和预防厌氧菌及病原虫，可用于治疗与预防滴虫病、球虫病及各种厌氧菌感染[1]。由于甲硝唑含有的硝基杂环类化合物存在细胞诱变性，因此，具有潜在的动物致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，其药物残留对动物源性食品安全构成了直接威胁[2]。为保证食品安全，我国对动物性食品中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑进行残留量监控。在现行的残留监控检测标准中[3-7]，需使用羟基甲硝唑对照品，但目前国内未见供应，因此，制备该对照品以满足行业需求。采用质量平衡法对羟基甲硝唑对照品进行定值研究，需分别测定标准物质中的有关物质、水分、残留溶剂及无机杂质的含量。羟基甲硝唑对照品在生产工艺中用到了甲醇和丙酮，因此，确定甲醇和丙酮为残留溶剂测定目标。本文参考文献中甲醇和丙酮的残留溶剂测定方法[8-10]，建立了顶空毛细管气相色谱法检测羟基甲硝唑对照品中的残留溶剂，并进行方法学研究，最终采用外标标准曲线法对其残留溶剂进行含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器 7890A气相色谱仪(包括7697A型顶空进样器，安捷伦科技公司)；XS205电子天平(Mettler Toledo公司，感量0.1 mg)；顶空进样瓶(20 mL，安捷伦科技公司)。

1.2 试剂 甲醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(Thermo Fisher公司，色谱纯)。

1.3 试药 羟基甲硝唑(成都大学四川抗菌素工业研究所制备，批号160815)。

1.4 色谱条件 色谱柱为Agilent DB-624石英毛细管色谱柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；程序升温：起始温度为30 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升温至200 ℃，保持2 min；进样口温度200 ℃；氢火焰离子化检测器(FID)温度为250 ℃；载气为高纯氮气，流量为3 mL/min，分流比为5∶1。

1.5 顶空进样器条件 顶空瓶平衡温度为80 ℃，顶空瓶体积为20 mL，供试的溶液体积为1 mL，平衡时间为30 min；定量环温度为90 ℃；传输线温度为105 ℃，分流比为1∶5。

1.6 溶液的制备

1.6.1 混合对照品溶液 取甲醇约0.1 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为甲醇对照品储备液；取丙酮约0.1 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为丙酮对照品储备液；精密量取甲醇对照品储备液0.3 mL、丙酮对照品储备液0.5 mL，置同一10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，配制成含甲醇300 μg/mL和丙酮500 μg/mL的混合对照品溶液。

1.6.2 供试品溶液 取羟基甲硝唑0.5 g，精密称定，置5 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成含羟基甲硝唑0.1 g/mL的供试品溶液。

1.6.3 空白溶液 N,N-二甲基甲酰胺为空白溶液。

1.6.4 检测限与定量限试验溶液 分别取甲醇和丙酮对照品储备液，逐级稀释为4、3、2、1、0.5 μg/mL甲醇对照品溶液，及3、2、1、0.5、0.25 μg/mL丙酮对照品溶液。

1.6.5 线性与范围试验溶液 分别取甲醇和丙酮对照品储备液，配制2、30、120、240、300、360 μg/mL的甲醇对照品溶液，及1、50、200、400、500、600 μg/mL的丙酮对照品溶液。

1.6.6 回收率试验溶液 取羟基甲硝唑0.1 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，用1 mL相当于混合对照品溶液浓度80%，100%，120%的含各溶剂的溶液(80%对照品溶液中甲醇浓度为240 μg/mL，丙酮浓度为400 μg/mL；100%对照品溶液中甲醇浓度为300 μg/mL，丙酮浓度为500 μg/mL；120%对照品溶液中甲醇浓度为360 μg/mL，丙酮浓度为600 μg/mL。)溶解，每个浓度点制备3份，作为回收率试验溶液。

2 结果与分析

2.1 专属性 分别精密量取空白溶液和混合对照品溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，进样，记录色谱图，见图1。结果显示，甲醇、丙酮的保留时间分别为4.478、7.718 min，空白溶剂N,N-二甲基甲酰胺的保留时间为16.840 min。甲醇、丙酮，N,N-二甲基甲酰胺分离度均大于1.5。表明顶空进样条件能够将甲醇和丙酮充分富集，色谱分离条件能够有效分离甲醇、丙酮，且N,N-二甲基甲酰胺对测定结果无影响，具有较好的专属性。

1:甲醇(methanol) 2:丙酮(acetion)图1 空白溶液(A)与混合对照品溶液(B)的气相色谱图Fig 1 GC chromatograms of blank solution(A) and substances solution(B)

2.2 检测限与定量限 分别精密量取甲醇和丙酮的检测限与定量限试验溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，进样，记录色谱图。以信噪比大于等于3∶1时的浓度为检测限，信噪比大于等于10∶1时的浓度为定量限，考察甲醇与丙酮的检测限和定量限。结果显示，甲醇检测限为1.0 μg/mL，定量限为2.0 μg/mL；丙酮检测限为0.5 μg/mL，定量限为1.0 μg/mL。

2.3 线性与范围 分别精密量取甲醇和丙酮的线性与范围试验溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，进样，记录色谱图。以峰面积与对照品浓度作图，用最小二乘法进行线性回归。结果显示，甲醇在2～360 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为Y=1807.5X-3.0667，相关系数r=0.9996；丙酮在1.0～600 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为Y=4754.3X+3.3266，相关系数r=0.9997。

2.4 精密度(重复性) 精密量取混合对照品溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，平行制备6份，进样，记录色谱图。结果显示，甲醇和丙酮峰面积的RSD分别为0.3%和0.4%(表1)。

表1 精密度试验结果(n=6)Tab 1 The results of precision test(n=6)

2.5 准确度 分别精密量取各浓度回收率试验溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，进样，记录色谱图，采用外标标准曲线法对残留溶剂进行含量测定。结果显示，甲醇回收率为98.0%～102.4%，RSD为0.6%～0.9%；丙酮回收率为97.0%～99.6%，RSD为0.6%～1.0%。表明两者均具有较好的回收率(表2)。

2.6 样品的测定 精密量取供试品溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，平行制备4份，进样，记录色谱图。结果测得，羟基甲硝唑中残留溶剂量分别为甲醇0.04%，丙酮0.01%(表3)。

表2 回收率试验结果Tab 2 The results of recovery test

表3 羟基甲硝唑残留溶剂测定结果Tab 3 The results of residual organic solvents testing of hydroxy metronidazole

3 讨论与结论

在性状考察中发现，羟基甲硝唑在水中几乎不溶，此种情况下可选用N,N-二甲基甲酰胺(或二甲亚砜)作为溶剂。经试验表明羟基甲硝唑在N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中溶解性好，且两种溶剂对待测组分均无干扰。但二甲亚砜比N,N-二甲基甲酰胺在柱中的保留时间长，所以为缩短分析时间，最终选择N,N-二甲基甲酰胺作为试验溶剂。

试验中发现，采用直接进样法进行测定，虽操作简便，但有未知峰干扰甲醇测定，改变载气流速、程序升温方式、色谱柱等条件，均不能将两者有效分离，考虑可能是样品中含有不挥发性组分所造成。后改用顶空进样法进行测定，未见未知峰干扰甲醇、丙酮的测定。该方法可有效避免未知物的干扰，且简便，干净，快速，仪器自动化程度高，可作为残留溶剂测定首选方法。

顶空进样法测定残留溶剂时，平衡条件对试验结果影响很大。为确定最佳平衡条件，分别对平衡温度60、70、80、90 ℃进行考察，结果表明同一浓度试液在上述不同平衡温度下，各待测物的峰面积在80 ℃时达到最大且保持稳定。确定平衡温度80 ℃后，又对平衡时间10、20、30、40 min进行考察，结果表明同一浓度试液在上述不同平衡时间下，各待测物的峰面积在平衡时间为30 min时达到最大且保持稳定，即各待测组分达到了气液两相平衡。因此，最终确定平衡温度为80 ℃，平衡时间为30 min。

本试验采用顶空气相色谱法，对羟基甲硝唑对照品中甲醇、丙酮两种有机溶剂残留量进行测定，该方法分离度、精密度和回收率等指标均能达到《中国兽药典》[11]中有机溶剂残留量测定法的要求，可用于羟基甲硝唑对照品中甲醇、丙酮残留量的检测，也可为其他药物中甲醇、丙酮残留量的检测提供参考。