8 周不同时间点有氧运动干预对脑卒中大鼠神经功能的影响

姜俐洋，史昱，黄传，苏悦，万春晓

（1.天津医科大学总医院康复医学科，天津300052；2.天津市海河医院康复医学科，天津300350）

脑卒中是全球第二大死亡原因和长期残疾的首要原因，具有很大的社会和经济负担[1]。在美国，每年大约有795 000 人患脑卒中或复发性卒中，其中40%的人导致终身残疾[1]。脑卒中后的有氧运动可以促进神经功能的恢复，提高患者的日常生活活动能力[2]。但脑卒中后的早期康复介入时间点仍然存在争议。Li 等[3]发现卒中后6 h 开始运动会加剧细胞凋亡，而24 h 后运动并不会导致这种现象。相反，Humm 等[4]发现卒中后24 h 开始运动会导致皮质组织进一步损伤。其他动物实验发现大鼠卒中后7 d开始运动会加剧大鼠运动皮质内前肢区域的损伤[5]。此外，早期运动中，只有轻度至中度运动可以促进卒中后大鼠恢复，而剧烈运动并不能改善卒中后功能[6]。这些研究共同强调了卒中后运动开始时间对损伤和身体残疾康复的重要性。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）参与调节缺血卒中后的一系列分子过程，如神经血管的重塑和修复、神经保护、神经发生等，使组织适应卒中后的状态[7]。但早期不同时间介入的运动训练是否可以调节VEGF 的表达，发挥保护神经的作用，目前少有研究证明。磁共振扩散张量成像（diffusion tensor image, DTI） 是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的特殊形式，而各向异性分数（fractional anisotropy，FA）是DTI 的衍生参数，其量化了脑白质中水扩散的方向性程度，是局部微结构完整性的替代度量[8]。在单侧大脑半球病变的疾病中，大多数研究都集中于患侧FA/对侧FA 的比值，即相对FA（relative FA，rFA）在预测神经恢复和运动恢复的作用[9]。本研究通过对大鼠进行脑卒中后1 d、1 周开始运动干预及静息干预，观察8 周干预对大鼠脑组织VEGF 蛋白表达、FA 值和神经功能评分的影响，探究脑卒中后不同时间点运动干预对神经功能的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取SPF 级雄性8~9 周Spra gue-Dawley（SD）大鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK 京2014-0004）24 只，体重280~310 g。将大鼠随机分为假手术组（SHAM 组）、静息组（SED 组）、术后1 d 开始运动组（EX-1D 组）、术后1 周开始运动组（EX-1W 组），每组6 只。

图1 实验流程图Fig 1 Experimental flow chart

1.2 大脑中动脉栓塞（middle cerebral ischemia occlusion, MCAO）再灌注模型制备 采用改良Longa线栓法制备左侧MCAO 模型[10]。大鼠经10%水合氯醛（300 mg/kg 体重）腹腔注射麻醉后，钝性分离和结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，向颈内动脉插入线栓（型号：2838-A4 北京西浓科技有限公司），深度1.8~2.0 cm。60 min 后取出线栓，建立MCAO 模型，手术总时长＜90 min，保持大鼠肛温（37±0.5）℃。假手术组暴露动脉，但不插入线栓，其余损伤同上。24 h 进行Longa 评分，1~3 分者纳入本实验[10]。

1.3 跑台训练及实验设计 运动组大鼠分别于造模后1 d 或1 周开始进行8 周运动，使用ZS-PT 小动物实验跑台（北京众实迪创科技发展有限责任公司），角度0°，速度12 m/min，30 min/d。大鼠停留至跑台末端时用软毛刷刺激促使继续运动，直至完成干预（图1）。

所有动物入组前均行3 d 的行为学评分预适应和跑台预适应，运动强度同前。排除标准：（1）预适应期间不能配合完成跑台运动。（2）造模后死亡。（3）造模24 h 后Longa 分不满足要求。

1.4 改良神经功能评分（modified neurological severity score, mNSS）测定 如前所述，采用mNSS 评分，分值为0~18 分，分值越大神经功能缺损越严重[11]。由同一实验人员分别于造模后1 周及干预8 周后进行评定。

1.5 FA 值的测定 造模后1 周及干预8 周后对各组进行DTI 和T2WI 扫描（SIEMENS MagnetomVerio 3.0T MR）。大鼠麻醉后仰卧位固定。T2-SPACE 序列，层厚=0.4 mm，扫描层数72 层，TR=1 000 ms，TE=155 ms，采集次数2 次，FA=120°，FOV=60 mm×60 mm，矩阵=192×192；同一实验人员在MRI 工作站采集和处理数据。根据大鼠脑图谱选取同一层面（Bregma-1.08～-4.20 mm）患侧受累内囊区域以及健侧对应等面积区域为感兴趣区测量FA 值，rFA=患侧FA/健侧FA。

1.6 VEGF 蛋白印迹检测 提取距离脑梗区3～4 mm的围梗死区脑组织总蛋白，采用BCA 试剂盒定量蛋白浓度。以β-Actin 作为等量蛋白质上样对照，取60 μg 蛋白/泳道进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离总蛋白，随后100 V 恒压将蛋白转至硝酸纤维膜上，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入VEGF（1:1 000，Abcam, UK）、内参β-Actin 抗体（1:1 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA），4°C 孵 育 过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）室温孵育1 h，ECL 化学发光法通过凝胶电泳成像仪显影。

1.7 统计学处理 数据用统计软件SPSS22.0 和Graphpad Prism6.0 处理，本研究中定量资料经Shapiro-Wilks检验后，数据均满足正态性，以(±s 表示。组间比较用方差分析，各组之间两两比较用LSD方法。各组VEGF 与mNSS、rFA值采用Pearson相关性分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠造模后1 周及干预结束后mNSS 评分的比较 在造模后1 周以及干预8 周后，对各组大鼠进行mNSS 评分。组内比较，SED 组、EX-1D 组、EX-1W 组在8 周干预结束时的mNSS 评分均明显降低（均P＜0.001）。各组组间比较中，在造模后1 周时，EX-1D 组大鼠mNSS 评分（8.17±1.169）分别明显低于SED 组（9.67±0.817，P=0.023）、EX-1W 组（9.33±1.211，P=0.039）。干预8 周后，与SED 组（4.67±0.817）相比，EX-1D 组大鼠mNSS 评分明显降低（2.67±0.817，P=0.002），而EX-1W 组没有出现显著变化（3.83±1.169，P=0.149）；与EX-1D 组比较，EX-1W 组大鼠mNSS 评分明显升高（P=0.049，图2）。

图2 各组大鼠造模后1 周及各组分别干预8 周后mNSS 评分变化Fig 2 Variance in mNSS scores after one week of modeling and after 8 weeks of intervention in each group

2.2 各组大鼠造模后1 周及干预结束后rFA 值的比较 组内比较，各组与造模后1 周相比，SED 组、EX-1D 组、EX-1W 组干预8 周后的rFA 值均明显升高（均P＜0.001）。组间比较，在造模后1 周，EX-1D 组大鼠的rFA 值（0.37±0.039）较SED 组（0.30±0.656）明显升高（P=0.049），而EX-1W 组与SED 组无明显变化（P=0.408）。干预8 周后，与SED 组（0.48±0.090）相比，EX-1D 组（0.72±0.071）、EX-1W 组（0.62±0.076）大鼠rFA 值均显著提高（均P＜0.001），且EX-1D 组rFA 值明显高于EX-1W 组（P=0.005，图3）。

图3 各组大鼠造模后1 周及干预8 周后rFA 值变化Fig 3 Variance in rFA values after one week of modeling and 8 weeks after intervention in each group

2.3 各组大鼠干预结束后脑组织VEGF 蛋白表达的比较 干预8 周后，与SHAM 组（0.82±0.191）相比，SED 组大鼠VEGF 蛋白表达量（0.45±0.160）明显降低（P=0.019），EX-1D 组（1.19±0.376）蛋白表达显著升高（P=0.017），而EX-1W 组（0.91±0.206）蛋白未出现统计学差异（P=0.543）。与SED 组相比，EX-1D 组、EX-1W 组VEGF 蛋白表达量均明显升高（PEX-1D=0.000，PEX-1W=0.005）。EX-1D 组的VEGF 表达略高于EX-1W 组，但无统计学差异（P=0.060，图4）。

图4 干预8 周后各组大鼠脑组织VEGF 蛋白表达Fig 4 VEGF protein expression in brain tissue of rats in each group after 8 weeks of intervention

2.4 各组大鼠VEGF 与mNESS、rFA 值的相关性分析 干预8 周后，将VEGF 蛋白表达与mNSS 评分、rFA 值进行相关性分析。在EX-1D 组、EX-1W 组中，VEGF 的增加与mNSS 评分的增加呈负相关（r=-0.816，PEX-1D=0.048；r=-0.829，PEX-1W=0.041）。在SED 组、EX-1D 组、EX-1W 组中，VEGF 的增加与rFA 值的增加呈正相关（r=0.872，PSED=0.024；r=0.831，PEX-1D=0.04；r=0.857，PEX-1W=0.029）。在EX-1W组中，rFA 值与mNSS 评分呈负相关（r=-0.854，P=0.03）（图5）。

图5 各组大鼠VEGF 与mNESS、rFA 值的相关性分析Fig 5 Correlation analysis of VEGF with mNESS and rFAin rats of each group

3 讨论

越来越多的证据支持卒中后的体育锻炼可以通过诱导神经可塑性来改善神经功能。美国心脏协会已经将有氧运动作为卒中康复中的基本组成部分[12]。由于医疗系统的巨大负担，大量研究重点关注卒中后的运动康复方案策略，通过减少卒中后认知和运动损伤促进患者恢复[13]。但对卒中后运动开始时间仍然有待深入研究，且多项相互矛盾的结果更突出了卒中后运动开始时间的重要性[3,12]。本研究通过对大鼠卒中后1 d、1 周开始运动组研究发现：与SED 组比较，造模后1 周时EX-1D 组mNSS 评分明显降低，rFA 明显升高（P=0.049），而EX-1W 组mNSS 和rFA 值无统计学差异。各组分别8 周干预后，EX-1D 组比EX-1W 组大鼠的mNSS 评分明显降低（P=0.049），rFA 值明显增高（P=0.005），EX-1D组的VEGF 表达略高于EX-1W 组，但尚未出现统计学差异（P=0.060）。VEGF 表达水平与mNSS 评分呈负相关，而与rFA 值呈正相关。这些结果表明，脑梗死后的运动干预对大鼠脑组织神经功能的恢复效果优于SED 干预，且EX-1D 组的干预效果更佳。这可能是由于运动促进了卒中后脑组织的VEGF 表达，改善大鼠的FA 值，促进神经功能的恢复。

FA 值是MRI 的一个参数，其变化可以反映几种生物学基础状态，比如轴突填充密度、轴突直径、髓鞘、神经突密度和取向分布[14]。研究验证了FA 值对卒中后运动恢复的影响[15]。一项荟萃分析的结果显示，多数卒中后运动研究中，FA 值与运动恢复结果显著相关[14]。Sidaros 等[16]发现，FA 值与神经纤维一致性及髓鞘数量呈正相关，FA 值较低可能是由于神经纤维的损害或者神经纤维一致性降低导致。笔者的研究发现EX-1D 组大鼠在脑卒中后干预8周后的rFA 值明显高于EX-1W 组，且mNSS 评分出现了相反的结果，表明脑卒中后1 d 开始干预，可以有效保护神经，改善大鼠的神经功能，促进运动恢复。

VEGF 涉及到血管生长的所有阶段，包括神经血管的发育, 由缺氧驱动的现有血管中的新毛细血管生成, 动脉生成及相应血压梯度的吻合小动脉通道的扩张[17-19]。VEGF 在卒中期间可以保护缺血性脑梗塞并促进闭塞的脑动脉再通[20]。此外，VEGF 可以促进多种神经元功能的恢复，包括神经元发生、神经元迁移、神经元生长等[21]。笔者的研究发现8 周干预结束后EX-1D 组大鼠的VEGF 表达水平高于EX-1W 组和SED 组，表明卒中后1 d 开始运动更能上调VEGF 的表达。

通过相关性分析，笔者发现VEGF 与mNSS 评分呈负相关，而与rFA 值呈正相关，表明运动通过促进VEGF 的表达，发挥神经保护作用，促进血管再通和神经发生，从而改善卒中后的病理状态。此外，EX-1D 组大鼠在干预结束时更高的VEGF 表达水平、rFA 值和更低的mNSS 评分，证明卒中后1 d开始的早期运动干预效果更佳。

本研究揭示了脑卒中后8 周运动干预对受损神经功能的保护和改善作用及其内在分子机制，并发现卒中后1 d 开始运动拥有更佳的治疗效果。但本实验样本例数较少，且早期不同干预时间点划分较为粗放，是否卒中后24 h 内或3 d 开始运动干预会有更好的治疗效果，今后的研究将进一步论证。

综上所述，笔者的研究证明，卒中后1 d 和卒中后1 周进行8 周的运动干预，可以通过上调大鼠VEGF 的表达，发挥神经保护和改善作用，促进神经功能的恢复，且卒中后1 d 开始干预的效果更佳。