缺血性脑卒中小鼠肾功能损害的相关研究

李文奎，苏悦，刘啸轩，乌日吉木斯，袁荃，阎涛，2

（1.天津医科大学总医院神经病学研究所，天津300052；2.天津医科大学总医院神经内科，天津300052）

研究表明，脑卒中不仅会损害神经系统本身，而且还会对心脏、肠道等多种器官的功能造成损害[1-4]。临床研究发现，肾功能损害是脑卒中住院患者中常见的并发症[5]。但是，目前对于脑卒中后肾功能损害发生率差异也很大，脑卒中患者人群中的肾功能改变研究甚少，一些研究是在不同的人种以及不同的脑卒中类型中进行的[6]。无论是在临床还是在基础研究中，脑卒中与肾功能损害的关系仍不清楚。在本研究中，笔者观察小鼠缺血性脑卒中肾功能改变，为将来进一步理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性C57BL/6 小鼠，20～25 g，8～12 周龄；购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物[许可证号：SCXK（京）2019-0008，批号：1103221911011874]全部饲养于天津医科大学总医院神经病学研究所的动物实验中心，饲养环境为SPF 级专业鼠房。采用简单随机抽样，将动物分为对照组、脑梗死3 d 组、脑梗死28 d 组，每组8 只小鼠。小鼠在适应环境1 周后进行造模处理，在脑梗死3 d 后或者脑梗死28 d 后将小鼠处死。

1.2 实验方法

1.2.1 缺血性脑卒中模型 本研究采用光化学法诱导局灶性大脑皮层缺血性脑卒中模型（photothrombotic models of ischemic stroke），可以造成持续的局灶性缺血病变，死亡率更低。主要建立方法：将预先配置好玫瑰红染料注射到小鼠的腹腔中，经过腹腔吸收进入血液循环，然后暴露小鼠颅骨，用绿光光源照射特定的区域20 min，局部大脑皮层血液中的玫瑰红在绿光照射后，发生化学反应，造成特定区域血管的阻塞，模拟缺血性脑卒中[7]。缺血性脑卒中模型构建结束以后，对缺血性脑卒中后的小鼠进行神经功能的评分[4]，把评分≥3 分的小鼠，纳入实验组；对于无症状、评分＜3 分的小鼠或者术后1 d 内死亡的小鼠排除实验组。本次实验中，每组造模10 只小鼠，实验过程中每组死亡2 只，最终每组8 只小鼠纳入实验研究。

1.2.2 小鼠标本的收集 采用代谢笼搜集小鼠造模前和造模后第3、7、14、28 天的尿液，搜集期间，小鼠在代谢笼内饮食和活动自由，分别提供12 h 的光照和12 h 的黑夜，保证其正常的睡眠节律。搜集到的尿液经过离心后取上清，在-80℃的条件下进行冷冻保存备用。采用眼球摘除法搜集缺血性脑卒中3 d 和28 d 的小鼠血液，然后离心取上清，在-80℃的条件下进行冷冻保存备用。将缺血性脑卒中3 d 和28 d 的小鼠进行麻醉后处死，摘取肾脏后，将肾脏制成石蜡标本，备用。

1.2.3 肾脏代谢指标的检测 使用小鼠尿白蛋白（urine albumin，UA）ELISA 试剂盒（ab108792，Abcam，Cambridge，UK）、小鼠尿β2-微球蛋白（β2-microglob ulin，β2-M）ELISA 试剂盒（KE1592，ImmunoWay）和肌酐比色测定试剂盒（500701，Cayman）测量UA、尿β2-M 和尿肌酐（urine creatinine，UCr）浓度。分别使用肌酐比色测定试剂盒（700460，Cayman）和Quanti ChromTM尿素测定试剂盒（DIUR-500，BioAssay System，USA）测量血肌酐（plasma creatinine，PCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）浓度。所有实验过程完全按照实验说明书进行操作。

1.2.4 肾脏病理染色 为了评估缺血性脑卒中后小鼠的肾脏损害程度，在缺血性脑卒中后3 d 和28 d 使用苏木素和伊红（HE，hematoxylin-eosin）对肾组织进行染色，进行肾脏病理评分。为了确定缺血性脑卒中对肾小球基底膜的影响，在缺血性脑卒中后3 d 和28 d 采用高碘酸-席夫试剂（PAS，periodic acid-schiff）染色，增厚的基底膜被染成紫色的面积就会增大。为了确定缺血性脑卒中后的肾纤维化程度，在缺血性脑卒中后第3 天和第28 天采用天狼猩红（PSR，picosirius red）染色，肾脏组织中的纤维增生部分会被染成红色。

1.2.5 肾脏组织学和病理学评估

1.2.5.1 肾脏病理学评分 使用半定量病理评分系统对肾脏进行肾组织病理评分（renal pathology score,RPS），简而言之，肾组织病理损害包括肾小管刷状缘膜缺失、肾小管的扩张、肾组织细胞肿胀、肾脏管腔碎片、核固缩和核缺失，这可以通过分级系统进行评分（0、1、2、3）：0 分：在高倍镜视野中无可见病灶；1 分：在高倍镜视野中损伤范围＜1/3；2 分：在高倍镜视野中，损伤范围＜2/3；3 分：在高倍镜视野中，损伤范围＞2/3 小管中的病理损伤。每个肾脏计数20 个视野（400 倍）。每个肾脏的总得分是来自20 个视野的所有得分的总和。

1.2.5.2 肾小球基底膜厚度（thickness of glomerular basement membrane，TGBM）测量 肾组织切片用PAS 染色以评估基底膜的增厚和肾小球系膜的扩张。总共计数30 个肾小球，使用光学显微镜（Olympus, Tokyo，Japan）对肾组织进行400 倍的放大[8]，所有实验均采用盲法进行计算和评估。

1.2.5.3 肾组织纤维化程度（renal fibrosis rate,RFR）测评 肾脏切片用PSR 染色，以计算胶原蛋白在肾组织中的沉积。在高倍镜下，采用随机原则，选择5 个视野进行计算，使用高倍显微镜将其放大200 倍；计算每个肾组织切片[9]。每个区域中的阳性面积百分比都要进行统计。因此，每个肾脏的得分就是5 个视野的阳性面积的百分比的平均值。所有实验均采用盲法进行计算和评估。

1.3 统计学分析 本次实验的所有数据都采用Graphpad Prism 8.0 进行统计分析，以mean±SEM 表示实验结果。两独立样本之间的比较采用非配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血性脑卒中对BUN 和PCr 的影响 脑梗死后第3 天，与对照组相比，BUN 显著升高（t=6.885，P＜0.05），PCr 差异无统计学意义（P＞0.05）；脑梗死后第28 天，与第3 天相比，BUN 明显下降（t=4.815，P＜0.05），PCr 差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 缺血性脑卒中对血肌酐和血尿素氮的影响Fig 1 Effects of ischemic stroke onplasma creatinine and blood urea nitrogen

2.2 缺血性脑卒中对尿β2-M、UA 和UCr 的影响 脑梗死后第3 天，与对照组相比，尿β2-M 和UA 显著升高（t=3.804，P＜0.05；t=2.638，P＜0.05）。脑梗死后第7 天，与第3 天相比，尿β2-M 和UA 明显下降（t=2.521，P＜0.05；t=2.521，P＜0.05）。脑梗死后UCr始终无明显变化（P＞0.05），见图2。

2.3 缺血性脑卒中对RPS、TGBM 和RFR 的影响 脑梗死后第3 天，与对照组相比，RPS、TGBM 和RFR 明显升高（t=2.181，P＜0.05；t=4.262，P＜0.05；t=7.366，P＜0.05）。脑梗死后第28 天，与第3 天相比，RPS 和RFR 明显升高（t=2.791，P＜0.05；t=6.187，P＜0.05）；梗死后第28 天，与对照组相比，RPS、TGBM 和RFR明显升高（t=4.065，P＜0.05；t=4.005，P＜0.05；t=6,178,P＜0.05），见图3。

图2 缺血性脑卒中对尿β2-M、UA 和UCr 的影响Fig 2 Effects of ischemic stroke on urine β2-microglobulin,urine albumin and urine creatinine

图3 缺血性脑卒中对RPS、TGBM 和RFR 的影响Fig 3 Effects of ischemic stroke on renal pathology score,thickness of the glomerular basement membrane and renal fibrosis

3 讨论

临床研究表明，肾功能损害在脑卒中患者中很常见[5,10-11]，并且肾脏疾病本身也是脑卒中的危险因素[12]。研究表明，和普通人相比，缺血性脑卒中患者肾功能损害的发病率明显升高[10]。但是，关于缺血性脑卒中后肾功能损害的发生率差异很大[13]。目前没有足够的证据表明肾功能损害与脑缺血性脑卒中之间存在因果关系。因此，研究缺血性脑卒中后肾脏功能损害具有重要意义。

在本次实验中，笔者观察了小鼠缺血性脑卒中后肾功能的变化，明确了缺血性脑卒中可以引起肾功能损害和肾组织病理损害。缺血性脑卒中会诱发急性肾脏功能损害，主要表现为缺血性脑卒中后BUN、UA、尿β2-M 一过性升高。同时，缺血性脑卒中也可以导致肾组织病理损害，在脑梗死后第3 天和第28 天，笔者发现其RPS、TGBM、RFR 明显升高。总而言之，缺血性脑卒中可以导致急性肾功能损害，同时可以导致急性和慢性肾脏病理损害，脑肾之间存在着必然联系。

白蛋白尿是公认的肾脏疾病现象，也是影响肾功能衰竭进展和过程的独立危险因素。β2-M 的分子量相对较小，血液中的β2-M 主要经过肾小球滤过，其中滤出的99.9%的β2-M 在肾脏近曲小管中被重新分解吸收，因此尿液中β2-M 的浓度极低[14]。尿β2-M 是早期检测急性肾脏损害（acute kidney injury，AKI）的标志物[15]。在一项前瞻性研究中，对252 例急诊科的儿童进行尿β2-M 检测，表明尿β2-M 在预测AKI 方面具有良好的准确性[16]。同时，尿β2-M 是肾小管和肾小球损害的重要标志物[17]。此外，尿白蛋白也是肾小管和肾小球损害的重要标志物[18]。肾小球阴离子电荷滤过屏障受到损害时，将会出现选择性白蛋白尿。其中尿液中出现白蛋白，通常意味着肾小球基底膜的结构严重受损[18]。笔者在缺血性脑卒中后第3 天发现，尿β2-M 和UA 明显升高，说明在缺血性脑卒中后，发生了急性肾脏功能损害，主要表现为肾小管和肾小球的损害。这与笔者在缺血性脑卒中后发现肾组织中肾小管扩张和肾小球基底膜增厚的现象是一致的。

PCr、UCr 和BUN 在肾脏疾病的诊断中具有重要意义[19-21]。本研究显示，缺血性脑卒中可以引起BUN 升高，但是对于PCr 和UCr 并无影响。有研究指出，在肾脏损害50%的情况下，PCr 浓度有不升高的情况，具体原因不详[22]。笔者推测可能是因为有部分肾功能的替代作用，使得肌酐清除并没有受到明显影响。

缺血性脑卒中引起脑实质的损害，进而影响了中枢神经系统，中枢神经系统的内侧前额叶皮层、下丘脑的损害，都可以对肾脏功能产生影响[23]。缺血性脑卒中引起交感神经兴奋，释放大量儿茶酚胺入血，引起肾动脉收缩，减少肾小球血流量，影响肾小球滤过率和加剧肾脏组织纤维化。此外，交感神经激活引起下丘脑视上核和室旁核释放抗利尿激素，通过V1 和V2 受体对肾脏功能产生影响。缺血性脑卒中可以对下丘脑-垂体-肾上腺轴产生影响，进而调节糖皮质激素的释放，影响肾小球和肾小管的功能[23]。而且，缺血性脑卒中可以激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血管紧张素Ⅱ通过诱导白细胞介素6 的产生，在肾组织纤维化中起着重要作用[24-25]。有研究发现，缺血性脑卒中引起大脑自主调节功能下降，进而引起肾小球滤过率的下降[26]。此外，缺血性脑卒中激活炎症和免疫反应，增加C 反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 等炎症因子进入组织和血液，进一步加剧肾脏损害，因此全身性炎症和免疫反应可能在促进缺血性脑卒中后肾功能损害中起重要作用。此外，细胞外囊泡也参与了缺血性脑卒中后的免疫反应调节过程，与肾脏的纤维化等病理损害有关[27-28]。笔者发现，在缺血性脑卒中后，肾组织纤维化程度明显加重。其中缺血性脑卒中第28 天比第3 天的肾组织纤维化程度增高。除此之外，肾组织病理损害评分也呈进行性增加趋势。总的来说，缺血性脑卒中后导致急性肾组织病理损害和慢性肾脏病理损害。有研究指出，肾脏结构受损后，会激活肾脏修复系统，其中肾脏修复系统的失控，最终导致间质纤维化和组织破坏，形成恶性循环，造成肾组织病理损害进行性加重。这与笔者的实验结论是一致的。

实验结果表明，缺血性脑卒中导致急性肾功能损害和急慢性肾组织病理损害。缺血性脑卒中主要通过对肾组织结构的破坏，影响肾脏功能，主要造成肾小管的扩张、肾组织纤维化、肾小球基底膜的增厚，引起BUN、UA、尿β2-M 的升高。本研究将为进一步研究缺血性脑卒中后肾功能损害的机制奠定基础。