鸡肉粉中猪源性成分的检测分析

张文刚 姜 芹 孙冰清 张 妤 顾 欣

上海市动物疫病预防控制中心，上海201103

近2年来，由于非洲猪瘟的影响导致鸡肉粉原料中掺假、掺杂猪肉粉现象频发，不仅严重侵害了饲料生产厂家的利益，而且也给非洲猪瘟的防控带来了很大安全隐患。为切实掌握饲料生产企业鸡肉粉原料中猪源性成分的污染情况，本文对来自宠物食品生产企业、饲料检测机构、企业内部质量检测机构及第三方饲料检测机构提供的61 个产品进行了猪源性成分检测分析。目前，现有的动物源性成分鉴别方法一般只是开展定性检测，结果以阴性或阳性的形式报告，这类检测结果无法区分是污染还是故意掺假所致，无法有效甄别是否存在掺假行为及其严重程度。因此，开展定量检测技术研究来量化鉴别某一动物源性成分含量十分必要[1-3]。本研究通过在鸡肉粉中添加不同比例的猪肉粉制作猪源性成分的含量标准曲线，通过标准曲线来确定样品中猪源性成分含量，基本实现了猪源成分的量化鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

检测样品来源于宠物食品生产企业、鸡肉粉生产、销售企业及检测机构；无水乙醇，国药集团试剂有限公司；DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；猪源性检测试剂盒，广州维伯鑫生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Light Cycler 96 型实时荧光PCR 仪，瑞士Roche 公司；涡旋仪，德国Heidolph 公司；AB135-S/FACT 电子分析天平，梅特勒托利多仪器上海有限公司；离心机，美国Thermo Scientific 公司；Nanodrop 分光光度计，美国Thermo Scientific 公司。

1.3 方 法

1）样品DNA 提取。本试验中DNA 提取采用天根生化科技（北京）有限公司生产的组织基因组DNA 提取试剂盒。称取约50 mg 试样，装入1.5 mL已灭菌的离心管中，然后按照试剂盒操作步骤进行NDA 提取，DNA 提取溶液于-20 ℃保存。在提取样品DNA 的同时，对阳性对照和阴性对照进行同法操作。

2）标准曲线制备。本试验以纯鸡肉粉为基质，纯猪肉粉为添加物质，分别配制猪肉粉含量为10%、1%、0.1%的样品，同时以纯猪肉粉为含量100%、纯鸡肉粉为猪肉粉含量0，提取DNA 后进行定量检测。试验数据以lg（猪肉粉百分含量）为横坐标，以对应的Ct 值为纵坐标绘制检测标准曲线。

3）添加回收试验。以纯鸡肉粉为基质，纯猪肉粉为添加物质，分别配制猪肉粉含量为50%、5%、0.5%的样品，提取DNA 后进行定量检测。每个浓度重复测3 次，每次2 个平行，考察方法的回收率及变异系数。

4）样品检测。本试验以样品DNA 提取液为模板，采用广州维伯鑫生物科技股份有限公司提供的猪源性检测试剂盒进行检测，引物序列为F：CGACAAAGCAACCCTCACAC，R：TGCGAGGGCG-GTAATGAT；探针序列为CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC。PCR 反应体系为25 μL，其中2×牛羊源性成分检测反应液12.5 μL、牛羊源性成分检测引物混合液和牛羊源成分检测探针混合液各1 μL、模板DNA（1～100 ng/μL）2 μL，灭菌双蒸水补足体系用量使总体积为25 μL。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。反应条件为：预变性95 ℃10 s；变性95 ℃5 s,退火延伸60 ℃30 s（收集荧光信号），40 个循环。反应结束后，利用仪器软件处理分析扩增曲线并确定循环阈值（Ct 值）。

2 结果与分析

2.1 样品DNA 提取

为保证检测结果的准确性，本研究对样品中提取的DNA 进行质量和浓度检测，用核酸蛋白浓度检测仪检测所有样品溶液的浓度，并稀释至50 ng/μL 后使用，纯度（D260nm/280nm）均在1.8～1.9 之间，表明提取的DNA 浓度和纯度较好，可用于下一步试验[4]。

2.2 标准曲线

按照纯猪肉粉为100%、鸡肉粉中猪肉粉含量为10%、1%、0.1%及纯鸡肉粉（猪肉粉含量0）的顺序进行检测分析，同时以Ct值为纵坐标，以lg（猪肉粉的百分含量）为横坐标制作标准曲线（图1）。本方法线性方程为y=-2.911x+21.68，R2=0.998，显示出较好的线性关系。

2.3 回收率及变异系数

按照1.3 中3）进行添加回收试验，考察方法的回收率。本试验中猪肉粉的加标回收率为90.9%～108.7%，变异系数≤5.7%（表1）。

2.4 实样检测

本研究对从不同环节收集到的61 批鸡肉粉样品进行了猪源性成分检测，其中检出含有猪源性成分的样品15 批，具体检出情况见表2。

3 讨 论

在目前的标准或文献报道中，动物源性成分检测使用的检测方法多是定性检测方法，这些方法不能对掺假的样品进行定量分析，因此需要建立准确性高、操作性强且易于推广的定量检测方法以满足行业管理需求。本研究通过在鸡肉粉中添加不同比例的猪肉粉制作猪源性成分的含量标准曲线，通过标准曲线来确定样品中猪源性成分含量，进而判断鸡肉粉原料是否故意掺假并衡量其掺假程度。试验结果显示，本方法中猪源性成分的检测限达到了0.1%（g/g），猪源性成分在0.1%～100%含量范围内，标准曲线线性关系良好（R2达到0.99 以上），模拟混合样品及实样检测均显示该方法准确度高、稳定性好。

图1 猪肉粉添加回收标准曲线

表1 血常规检测结果

表2 鸡肉粉中猪源性检测阳性结果

本文通过对市场上收集到的61 批鸡肉粉进行筛查检测，初步掌握了鸡肉粉中猪源性成分的含量及其污染情况。检测样品从抽样环节上分，来源涵盖了饲料检测机构、鸡肉粉、经营和使用企业（宠物饲料生产企业）等各个环节；从产地上分，样品包含了国内产品和进口产品两类，其中进口产品6 批，国产样品55 批，分别来自广东、山东、四川、上海、湖北等地。在检测的61 批鸡肉粉样品中，检出含有猪源性成分的样品15 批，总体检出率为24.6%，其中含量超过10%的样品有4 批，占6.55%，含量最高的甚至达到了纯猪肉粉的程度；含量在0.5%～10%之间的有7 批，占11.5%；检出但含量小于0.5%的有4 批，占6.55%；未检出猪源性成分的有46 批，占75.4%。总体上来说，市场上鸡肉粉中猪源性成分的检出率较高，应当加强对鸡肉粉原料中猪源性成分的检测和监管。