应用iTRAQ 技术筛选肺叶切除术患者单肺通气前后血清差异表达蛋白质

张浩，李明，李鹏

(潍坊市益都中心医院，山东 潍坊)

0 引言

单肺通气(one-lung ventilation，OLV) 是一种经支气管导管仅利用单侧肺( 非手术侧肺) 进行通气的方法，一方面能够隔离患侧肺，避免患侧肺对健侧肺的污染，另一方面可以使两侧肺分别通气，患侧肺萎陷停止呼吸，为手术提供良好的视野。近年来，随着胸外科手术的快速发展及胸腔镜技术的推广，OLV 的应用也越来越广泛[1]。但是OLV 期间术侧肺的血液未能得到充分的氧合导致肺内分流的增加，进而引起肺组织缺氧，导致低氧血症，造成肺组织细胞的损伤和功能损害。此外长时间的肺萎陷、多次的肺复张以及术中手术操作对肺组织的牵拉、挤压等也会对肺组织造成一定的程度的损伤，甚至可以引起呼吸机相关性肺损伤(ventilator associated lung injury，VALI)导致肺部并发症甚至死亡率的增高。iTRAQ 技术是近年来开发的一种可同时对八组样本进行定性和相对定量分析的蛋白组学技术，结合多维液相色谱和串联质谱技术现已成为差异蛋白质组学定量研究的主要工具，广泛的应用于肿瘤生物学标志物的寻找等领域。本研究旨在利用iTRAQ 技术筛选肺叶切除手术患者单肺通气前后发生差异表达的蛋白，为进一步研究单肺通气肺损伤的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

5800 MALDI-TOF/TOF 质 谱 仪( 美 国)、Nano-Tempo LC 点靶仪(加拿大)、iMark 型酶标仪(美国)、Agilent 1200 series 液 相 色 谱 仪( 美 国)；iTRAQ 8 标Buffer 试 剂 盒( 美国)、iTRAQ 8 标试剂盒(美国)、胰酶(美国Promega 公司)、Agilent Buffer A 和B(美国)、Multiple Affinity Removal System(MARS) Human 14 亲和层析柱(美国)。

1.2 样本采集及分组

血清样本取自2011 年3 月至2011 年10 月于东南大学附属江阴市人民医院胸外科行肺叶切除术患者。入选标准：ASA Ⅰ或Ⅱ级；1 周内无感染病史，无皮质激素和抗生素使用史；患者肺功能正常或仅有轻度的通气功能障碍；无肝肾功能障碍。排除标准：因个体差异或者体位问题导致双腔管管口定位不良，血氧饱和度无法维持在90%以上；OLV 时间不足2h 或者大于4h；术中出现大的血流动力学波动。各例手术均采用相同的麻醉方法、麻醉机和监护设备，由相同的麻醉医生进行操作。标本采集经过医院伦理委员会批准和患者本人或

者家属的知情同意，在手术开始前和手术结束后即时取中心静脉血5mL 于促凝管内，分别记为OLV 术前组和OLV 术后组，室温放置30min，4℃恒温离心机3000r/min 离心20min，取上层血清，置于-80℃保存。

1.3 去除高丰度蛋白

-80℃保存的血清冰上复溶，各组的20 例样本分别以5μl 等体积混合后，使用免疫亲和色谱柱缓冲液A(Buffer A)稀释4 倍，0.22μm 孔径离心滤膜16000g 离心1min 去除颗粒物质。单次上样量80μl，应用MARS HUMAN-14 免疫亲和色谱柱去除血清中的白蛋白、IgG、转铁蛋白等14 种高丰度蛋白。过柱后得到的低丰度蛋白馏分采用5K MWCO 的离心浓缩器进行浓缩，浓缩后采用BCA 定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.4 胰酶酶解和iTRAQ 标记

各组样本分别取100μg 蛋白进行变性、还原、半胱氨酸修饰和胰酶酶解等处理后，采用iTRAQ 试剂进行标记OLV术前组和OLV 术后组分别采用113 和114 标记。

表1 术前组和术后组比较，上调或者下调差异1.5 倍以上的蛋白质

1.5 二维液相色谱-串联质谱分析

标记后的多肽混合物使用Spin Colum 进行脱盐处理后，应用配有强阳离子交换(SCX)色谱柱的液相色谱仪进行第一维色谱分离，然后使用装有反相-c18 柱的TempoTM LCMALDI 点靶仪进行第二维反相色谱分离并点靶。点靶完成后使用MALDI-TOF/TOF 5800 型质谱仪进行质谱分析。

1.6 数据分析

质谱数据分析使用ProteinPilot 软件，搜索IPI 人类蛋白质数据库。选择可信度≧95%或者Protscore ≧1.3 的蛋白进行报告，以113 为对照，比值≧1.5 或者≦0.67 作为阈值选取差异蛋白。差异蛋白的注释和分类使用DAVID 的功能注释，其中选择GO(gene ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类，选择KEEG 的通路数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。

2 结果

2.1 质谱鉴定结果

质谱数据利用Protein Pilot 软件搜库得到可信度大于95%即Unused Protscore ≧1.3 的蛋白189 种，其中差异表达的蛋白42 种，较通气前上调的蛋白有20 种，下调的蛋白有22 种，见表1。

2.2 生物学功能分析

对单肺通气过程中发生差异表达的42 种蛋白进行基因功能聚类分析(gene ontology，GO)和KEEG 通路分类和富集分析后发现这42 种蛋白主要参加急性炎症反应、补体系统的激活、细胞凋亡调节、蛋白水解作用、趋化反应等生物学过程；细胞组分主要为血浆膜蛋白、核孔复合体、膜攻击复合物、细胞质膜结合蛋白等；分子功能主要以结合和催化功能为主；富集到的通路主要为趋化因子和细胞因子介导的炎症信号通路、凝血级联反应等。

3 讨论

随着对单肺通气肺损伤信号转导通路研究的深入，发现不论是缺血缺氧性损伤、机械牵张性损伤还是生物性损伤其对肺组织的损伤作用大都转归到细胞因子和趋化因子引起的炎症反应上，了解这些细胞因子或趋化因子的变化规律对更加深入的阐释肺损伤的发生机制具有重要的意义。iTRAQ 技术能够动态、整体地考察疾病发生、发展过程中蛋白质种类、数量的改变，对进一步阐释疾病的发病机制具有重要的意义。本研究利用该技术对肺叶切除手术患者单肺通气前后的血清进行分析，发现了42 种差异蛋白。

本研究结果中，单肺通气后表达上调的蛋白中有3 个为急性相反应蛋白，分别为α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C 反应蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶由肝脏产生，是人体内血清蛋白溶解酶的主要抑制物。正常人肺组织内，分解肺组织的蛋白酶与抑制蛋白酶活性的α1-抗胰蛋白酶之间处于动态平衡状态，从而维持肺组织正常的结构免于破坏。当肺部炎症时，血清中中性粒细胞和肺泡巨噬细胞释放出大量的弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶，α1-抗胰蛋白酶也随之升高。揭志军[2]等研究发现预防性静脉注射α1-抗胰蛋白酶能够提高体内抗蛋白酶的活性，减轻中性粒细胞蛋白酶(NE)对细胞外基质和血管屏障的损伤，减轻血管通透性的增高，使肺损伤减轻。C-反应蛋白和SAA 是敏感的炎症指标，在白细胞介素(IL)-1、IL-6 和TNF 刺激下，由肝脏中被激活的巨噬细胞合成。Li[3]等人的研究发现在内毒素导致的肺损伤模型中，CRP 发生了明显的升高。Steven Bozinovsk[4]的研究认为SAA可以作为慢性阻塞性肺部疾病急性发作的标志物。

S100 A8 蛋白是近年来发现的一种低分子量钙结合蛋白，具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及参与炎症反应等作用[5]。该蛋白主要由激活的中性粒细胞、单核巨噬细胞释放，反过来在炎症反应时通过改变细胞骨架结构，增加白细胞变形的能力，使大量的白细胞通过变形渗透到反应部位或聚集到微血管处，导致炎症反应的级联放大进而加重损伤。此外，研究发现 S100A8 蛋白同NFкB 和MAPK 通路也有着密切的关系。Szekanecz[6]等研究发现NFкB 通路抑制剂能够明显的抑制S100A8 介导的促炎因子的产生。Endoh[7,8]等研究发现钙卫蛋白同其受体RAGE 的相互作用可使P38MAPK、ERK 和SAPK/JNK 磷酸化导致激活进而导致炎症反应。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，简称TSP-1)，是一种细胞外糖蛋白，可由多种细胞分泌，如肺泡细胞、巨噬细胞、单核细胞等。TSP-1 与TGF-β 有高度的亲和性，能够有效的促进TGF-β 由潜在形式进入激活状态，它能够促进胶原纤维的产生和基质沉淀，调节纤维蛋白溶解酶的产生，具有重要的抗炎症作用[9]。Sakurai[10]等研究发现阻断TGF-β 的激活可以有效的减轻机械通气导致的肺损伤，而TSP-1 为TGF-β 重要的激活因子。

本研究利用iTRAQ 技术构建了肺叶切除术患者单肺通气前后的差异表达蛋白图谱，为进一步的了解单肺通气肺损伤的发病机制，并进行早期的干预和治疗提供了重要的理论和实验依据。但本实验仅为初步研究，样本量相对较少，所筛选出的一系列差异蛋白尚需扩大样本量进一步验证。