红细胞溶血试验用于评价淋洗类化妆品眼刺激性的初步研究

田妮娜，刘兴国，李 岩，王月玲

（兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050）

兔眼刺激性试验（Draize 试验）是指动物眼球接触到化学物质产生炎症反应的过程，是目前评估眼刺激性的金标准[1-2]，通过实验人员肉眼观察血红蛋白的漏出和变性进行评分，方法周期长、成本高，存在一定的主观性和差异性；同时,随着动物保护运动的兴起和人们对“3R”运动的关注[3],体外替代试验的研究已广泛开展[4-7]。

红细胞溶血试验（RBC）的基本原理是化学物质损伤细胞膜，改变其渗透性，引起血红蛋白的漏出和变性，进而导致溶血发生[8]。含表面活性剂的产品主要通过破坏眼部脂质和蛋白结构导致损伤，这和红细胞溶血试验的基本原理类似[9]。故本研究收集易触及眼睛的4类淋洗类化妆品（洗发、护发、沐浴和洁面），参照《化妆品卫生规范》(2007年版)规定的眼刺激试验的要求，进行红细胞溶血试验和Draize试验，并评价其相关性，以考察红细胞溶血试验用于评价淋洗类化妆品眼刺激性的可行性。

1 材料与方法

1.1 样品

样品一部分来自兰州市药品检验所送检的化妆品，其余部分市场购买，洗发、护发、沐浴和洁面4类各20批次，配方中均含有表面活性剂。

1.2 2%红细胞悬液（牛、羊、猪、兔）

购自北京博尔西科技有限公司和岑溪鸿泉生物科技有限公司，100ml/瓶，2-8℃保存，3-4周内使用。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，NaCl8g，KCl 0.2g,溶于1000ml纯化水中，pH 为7.4，121℃灭菌30min），十二烷基硫酸钠（SDS）（1000mg/L）。

1.3 实验动物

新西兰大耳白兔，普通级，雌雄兼用，雌性未孕，购自兰州畜牧兽医研究所，并饲养在兰州市食品药品检验所药理室普通级动物房。实验动物合格证：SCXK（甘）2015-0001号。

1.4 主要仪器

艾本德紫外分光光度计，艾本德高速离心机，IKA振荡培养箱。

1.5 实验方法

1.5.1 红细胞溶血试验

先进行预试验预测样品的HD50范围。样品用PBS配制成浓度为10000mg/L（w/v）的贮备液，超声振荡使其完全溶解。取不同浓度的样品溶液 （逐级稀释贮备液至 1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）、PBS（空白对照）、纯化水（全溶血对照）、SDS（阳性对照）各1.5mL，分别加入0.5mL羊红细胞悬液，在32℃培养箱中振荡孵育30min，13000r/min离心2min，取上清液，以PBS为空白对照，测定540nm、560nm、575nm波长下的吸光度(A)。

通过预试验，预确定HD50的样品浓度，为准确的测定HD50值，在预测值上下均匀布置5个浓度，用PBS配制成浓度为2倍预测值的样品贮备液，然后按照表1设计的方案进行试验。

表1 试验方案

用双复管测定，取平均值，以A560纵坐标，样品浓度（mg/L）为横坐标作线性回归方程,计算HD50，血红蛋白变性指数（DI）和HD50/DI，同时比较四种属间实验结果的差异。

1.5.2 家兔眼刺激试验

按《化妆品卫生规范》（2007）对受试样品进行眼刺激性分级[9]。

2 结果

2.1 试验结果

80种化妆品体内试验(兔眼刺激试验)和四种红细胞(牛/羊/猪/兔)溶血性试验结果进行比较，见表2。

表2 80种化妆品体内试验和四种红细胞溶血性试验结果比较

2.2 统计分析

应用SPSS进行数据分析。经Kruskal-Wallis检验,在α=0.05的水平下，每类产品的动物试验和四种溶血试验之间无显著性差异 (P＞0.05)，但汇总80种化妆品后，P=0.01，存在一定差异，主要是兔红细胞溶血实验引起的差异。分析兔红细胞溶血试验的数据，发现其HD50值均高于牛、羊、猪红细胞溶血试验的，DI值没明显区别，故导致HD50/DI值略高，产生差异。经kappa一致性检验，得出动物试验和兔红细胞溶血试验一致性一般，牛、羊、猪红细胞溶血试验一致性良好。

3 讨论

1)对受试物与红细胞悬液作用的体积比进行选择，用不同体积比的纯化水与绵羊红细胞悬液混合，发现体积比为1∶3时，红细胞发生全溶血。故选用体积比为 1∶3。

2)对测量波长进行选择，采用不同浓度SDS，分别与羊红细胞悬液作用，在540nm、560nm、575nm测定吸光度A，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线，各波长在100mg/L处吸光度达到最高峰（即红细胞发生蛋白变性），在560nm波长下最高峰后曲线接近直线，故选择560nm为测量溶血波长；540nm和575nm波长下最高峰后曲线明显下降，但在1000mg/L后，其曲线不再下降（即蛋白不在变性），故选择1000mg/LSDS作为血红蛋白变性的阳性对照。

3)对北京博尔西科技有限公司和岑溪鸿泉生物科技有限公司的红细胞悬液进行比较研究，其制备方法、检测报告参数、四种红细胞悬液溶血试验结果基本相同，故市售的成品红细胞悬液可以直接用来开展溶血试验，但一定注意保存条件，且在效期内使用。

4)本试验中，牛、羊、猪红细胞溶血试验和Draize试验之间无显著性差异，研究表明，溶血试验适用于含表面活性剂的产品，洗发、护发、沐浴和洁面4类淋洗类产品均含有表面活性剂，因此，可以作为淋洗类化妆品眼刺激试验的一个初筛试验。同时，本研究收集4类化妆品中所用到的表面活性剂，覆盖阴离子、阳离子、两性离子、非离子表面活性剂，刺激性涵盖各个刺激反应分级，溶血试验和体内试验相关性良好，进一步证明红细胞溶血试验可用于评价淋洗类化妆品眼刺激性。

5)由于动物种属间红细胞膜结构存在一定差异，牛、羊、猪红细胞溶血试验与兔红细胞溶血试验相比，更适合于淋洗类化妆品眼刺激试验的一个初筛试验。试验方法简单快速，重复性良好,无需细胞培养，对于淋洗类化妆品眼刺激试验具有较好的眼刺激性预测能力，是一种有潜力的替代方法。