不同浓度黄芪总黄酮对高糖诱导人脐静脉系内皮细胞损伤的保护作用*

唐 静 许娟娟 袁秀芝

华中科技大学同济医学院附属梨园医院药剂科，武汉 430077

我国是糖尿病大国，预计到2030年中国的糖尿病患病人数将达到1.40亿[1]。糖尿病的发生与氧化应激密切相关，机体一旦出现氧化应激反应，微循环会受到破坏，继而累及血管内皮细胞。黄芪是常用中药，研究[2]表明其能改善氧化应激，从而改善糖尿病带来的不利影响。本实验通过在高糖环境中培养人脐静脉系内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，比较了不同浓度黄芪总黄酮提取物对高糖损伤HUVECs细胞的保护作用，并检测了影响血管内环境的NO、T-SOD、ET-1的含量，为黄芪总黄酮的降糖研究提供了进一步的证据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

HUVECs购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂

黄芪总黄酮提取物(自提)，葡萄糖(南京建成生物工程研究所)，甘露醇(中国医药集团上海化学试剂公司)，总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)，一氧化氮(nitric oxide，NO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Trizol试剂(Aidlab公司)，DL2000 DNA Marker(TAKARA公司)。DMEM培养基(低糖型)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.3 主要仪器

R-205型旋转蒸发仪(瑞士BuChi公司)，EDC-810型PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)，Multiskan MK3全自动酶标仪(Thermo scientific)，C2500-R-230V微型高速离心机。

1.4 细胞处理

采用随机数字表法将HUVECs细胞分为：①正常对照组，加入5.5 mmol/L葡萄糖；②高糖模型组，加入30 mmo1/L葡萄糖；③高渗对照组，先加入24.5 mmol/L甘露醇，2 h后加入5.5 mmol/L葡萄糖；④黄芪总黄酮高剂量组，先加入2 mg/mL黄芪总黄酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖；⑤黄芪总黄酮中剂量组，先加入1 mg/mL黄芪总黄酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖；⑥黄芪总黄酮低剂量组，先加入0.5 mg/mL黄芪总黄酮，2 h后加入30 mmol/L葡萄糖。以上5组细胞处理完毕后置于CO2培养箱中37℃，5% CO2培养，24 h后进行指标检测。

1.5 检测指标

1.5.1 NO、T-SOD水平 各组细胞均在高糖处理前分别加入药物，培养24 h后取细胞上清液，按照试剂盒使用说明书进行操作，检测各组细胞NO、T-SOD水平。

1.5.2 病理变化 将各组细胞采用4%多聚甲醛固定爬片，常规HE染色，在200倍显微镜下进行观察。

1.5.3 RT-PCR检测ET-1 mRNA水平 通过Trizol法提取RNA后，逆转录成cDNA，设计相应的引物。采用实时荧光定量PCR检测，测定HUVECs细胞内ET-1 mRNA的表达。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析各组ET-1 mRNA表达[3]。引物序列见表1。

1.5.4 Western blot法检测ET-1蛋白表达 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，加入4℃预冷的PBS液洗涤细胞后加入裂解液，充分裂解后，12 000 rpm离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，-20℃冻存备用。30%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，用1×TBS漂洗一次，加入含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h，分别加入一抗，4℃过夜，洗膜后分别加入HRP标记二抗，37℃摇床孵育2 h，用TBST充分洗涤PVDF膜；加入增强化学发光试剂(ECL)后置于曝光机上曝光，用BandScan软件分析胶片灰度值，以GAPDH作为内参计算相对表达量。

表1 PCR引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪总黄酮对高糖损伤HUVECs NO、T-SOD水平的影响

培养24 h后，与正常对照组比较，高糖模型组NO、T-SOD水平明显降低(P<0.05)。与高糖模型组比较，黄芪总黄酮高、中、低剂量组NO、T-SOD水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞NO、T-SOD水平比较

与正常对照组比较，*P<0.05；与高糖模型组比较，△P<0.05

2.2 黄芪总黄酮对高糖损伤HUVECs形态的影响

HE染色显示，正常对照组、高渗对照组HUVECs大小均匀；高糖模型组视野内细胞数量减少，大小分布不均；黄芪总黄酮高、中、低浓度干预后，细胞数量出现了明显的增加，形态较高糖模型组略为规整；且随着黄芪总黄酮浓度的变化，细胞数量也呈现出不同的变化，黄芪总黄酮高剂量组的细胞数量增加最为显著。见图1。

2.3 黄芪总黄酮对高糖损伤HUVECs ET-1 mRNA水平的影响

不同组别扩增出来的内参GAPDH表达一致，说明整个实验体系正常，见图2。与正常对照组比较，高糖模型组的ET-1 mRNA表达明显升高(P<0.05)。与高糖模型组比较，黄芪总黄酮高、中、低剂量组ET-1 mRNA表达显著下降(P<0.05)，且黄芪总黄酮高剂量降低最为显著(P<0.05)。见图3及图4。

1为正常对照组；2为高糖模型组；3为高渗对照组；4为黄芪总黄酮高剂量组；5为黄芪总黄酮中剂量组；6为黄芪总黄酮低剂量组

1为DL2000；2为正常对照组；3为高糖模型组；4为高渗对照组；5为黄芪总黄酮高剂量组；6为黄芪总黄酮中剂量组；7为黄芪总黄酮低剂量组

1为DL2000；2为正常对照组；3为高糖模型组；4为高渗对照组；5为黄芪总黄酮高剂量组；6为黄芪总黄酮中剂量组；7为黄芪总黄酮低剂量组

1为正常对照组；2为高糖模型组；3为高渗对照组；4为黄芪总黄酮高剂量组；5为黄芪总黄酮中剂量组；6为黄芪总黄酮低剂量组

2.4 黄芪总黄酮对高糖损伤HUVECs ET-1蛋白表达的影响

不同组别内参GAPDH表达一致，说明整个实验体系正常，见图5。与正常对照组比较，高糖模型组的ET-1蛋白表达明显升高(P<0.05)。与高糖模型组比较，黄芪总黄酮高、中、低剂量组ET-1蛋白表达显著下降(P<0.05)，且黄芪总黄酮高剂量降低最为显著(P<0.05)。见图6及图7。

1为正常对照组；2为高糖模型组；3为高渗对照组；4为黄芪总黄酮高剂量组；5为黄芪总黄酮中剂量组；6为黄芪总黄酮低剂量组

1为正常对照组；2为高糖模型组；3为高渗对照组；4为黄芪总黄酮高剂量组；5为黄芪总黄酮中剂量组；6为黄芪总黄酮低剂量组

1为正常对照组；2为高糖模型组；3为高渗对照组；4为黄芪总黄酮高剂量组；5为黄芪总黄酮中剂量组；6为黄芪总黄酮低剂量组

3 讨论

HUVECs在循环血液和血管壁之间起到天然屏障作用，对神经、体液，特别是血流动力学变化作出反应。高糖毒性会诱导血管内皮细胞活性氧生成增多，产生氧化应激反应；应激产生的多种炎性因子，会引起血管内皮细胞损伤，造成血管内皮细胞功能障碍。黄芪作为经典的中药，其主要成分黄芪皂苷[4-5]、黄芪多糖[6-7]和黄芪总黄酮均有降糖疗效，目前对黄芪皂苷和黄芪多糖的高糖损伤保护作用的探讨较多，本研究主要从从细胞学的角度，研究了黄芪总黄酮可抑制氧化应激、改善内皮细胞功能，从而保护了HUVECs免受高糖损伤。

HE染色可以直观清晰地反映细胞结构，染色后的细胞浆呈粉红色，通过不同剂量黄芪总黄酮干预后，在光学显微镜下，能直接观察各组细胞的数量变化。血管内皮细胞覆盖于血管内膜表面直接与循环血液接触，很容易受到血液中活性物质的影响，NO和ET-1分别为重要的血管舒张因子及收缩因子，在维持内环境的稳定性方面起着重要作用[8-9]。T-SOD是一种重要的内源性活性物质，可消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质[10]。本研究结果发现，与正常对照组比较，高糖模型组细胞NO、T-SOD水平明显降低，细胞数量减少，ET-1 mRNA及蛋白表达显著升高，说明高糖对HUVECs会造成明显损伤；与高糖模型组比较，黄芪总黄酮高、中、低剂量组NO、T-SOD水平明显升高，细胞数量增加，ET-1 mRNA及蛋白表达显著降低，说明黄芪总黄酮能对高糖损伤HUVECs产生一定的保护作用，其作用机制很可能是通过抑制HUVECs中ET-1的分泌而实现的；且高、中、低剂量黄芪总黄酮对HUVECs的保护作用，存在一定的剂量相关性，剂量越大则对HUVECs的保护作用越显著。改善高糖引起的血管内皮功能紊乱的机制较为复杂，本实验通过ET-1途径来研究高糖损伤HUVECs略显单薄，下一步可对其保护机制进行进一步的探讨。

综上所述，不同浓度黄芪总黄酮对高糖损伤的HUVECs细胞均有保护作用，可促进NO、T-SOD分泌，提升细胞数量，抑制ET-1 mRNA及蛋白表达，且高浓度黄芪总黄酮的保护效果最为显著。