转录激活因子-4、第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂在卵巢癌组织中的表达及临床意义

于钦德，陈传凤，吴海卫

淄博市第一医院1妇科，2肿瘤一科，山东淄博255200

卵巢癌的发病率较高，严重威胁患者的健康和生命，在部分高危人群中，卵巢癌的发病率可超过约578/10万[1]。卵巢癌具有较高的病死率和致残率，中晚期患者的病情进展速度较快，远期多器官功能衰竭的风险较高[2]。在研究卵巢癌发病分子机制的过程中，越来越多的研究关注到，肿瘤调控蛋白的改变能够在卵巢癌细胞生物学行为的调控过程中发挥作用。转录激活因子-4（activating transcription factor-4，ATF-4）是转录调控相关因子，能够提高肿瘤细胞上游转录本序列的阅读开放框的激活程度，最终加速卵巢癌细胞核DNA的异常分裂[3-4]。第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（second mitochondria-derived activator of caspase，SMAC）是线粒体活性调节因子，能够通过稳定线粒体和细胞能量代谢，最终稳定肿瘤细胞的增殖过程[5]。为了揭示ATF-4、SMAC的表达与卵巢癌的关系，从而深入揭示卵巢癌的发病机制，并为卵巢癌的诊疗提供参考，本研究选取90例卵巢癌患者的卵巢癌组织，探讨ATF-4、SMAC蛋白的表达情况与卵巢癌患者病理特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年9月至2018年4月淄博市第一医院收治的卵巢癌患者。纳入标准：①卵巢癌的诊断符合相关诊断标准[6]；②卵巢癌组织来源于手术后，经病理学检查证实为上皮性卵巢癌；③患者手术前未接受放化疗、免疫学治疗；④临床资料完整。排除标准：①合并盆腔、腹腔等其他类型肿瘤；②合并生殖系统、泌尿系统和盆腔感染性疾病；③伴有免疫系统疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入90例卵巢癌患者，其年龄为36～67岁，平均年龄为（55.1±8.0）岁；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）：I期22例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例，Ⅳ期3例；病灶直径：≥5 cm 50例，＜5 cm 40例；有淋巴结转移44例，无淋巴结转移46例；组织学分级：G1级24例，G2级37例，G3级29例；病理学类型：浆液性囊腺癌64例，黏液腺癌26例。另选取90例卵巢良性肿瘤患者，其年龄为38～69岁，平均年龄为（57.8±7.0）岁；黏液性囊腺瘤52例，浆液性囊腺瘤28例，其他类型10例。两组患者的年龄、FIGO分期等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。分别收集两组患者的卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织标本进行研究。

1.2 免疫组织化学染色方法检测蛋白阳性表达率

收集患者的卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织，3%的过氧化氢室温条件下孵育20 min，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min，采用PBS稀释后的山羊血清封闭抗体5 min，倒去血清后不清洗，滴加一抗（稀释浓度为1∶1000）5 ml，37℃孵育2 h，或置于4℃冰箱过夜孵育，PBS清洗3次，每次5 min，滴加生物素荧光标记的二抗（稀释浓度为1∶2000）3 ml，37℃孵育20～30 min，PBS清洗3次，每次5min，加入链霉亲合素/辣根过氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）标记的链霉卵白素，37℃孵育 20～30 min，PBS清洗3次，每次5 min，采用增强型HRP-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物显色试剂盒（PA110）显色，自来水冲洗，复染，封片。

1.3 免疫组织化学染色结果判定标准

ATF-4、SMAC蛋白定位于细胞核、细胞质，当二者染色呈黄色、棕黄色、褐色时，说明为阳性表达。依据染色程度进行评分：未染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，褐色、黑色计3分。依据阳性细胞所占百分比进行评分：≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。将染色程度与阳性细胞所占百分比的评分相乘，＜3分为ATF-4、SMAC表达阴性，≥3分为ATF-4、SMAC表达阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中ATF-4、SMAC蛋白的阳性表达情况

免疫组化染色结果显示，上皮性卵巢癌组织中ATF-4的阳性表达率为70.00%（63/90），明显高于卵巢良性肿瘤组织的35.56%（32/90），差异有统计学意义（χ2=21.422，P＜0.01）。卵巢癌组织中SMAC蛋白的阳性表达率为45.56%（41/90），明显低于卵巢良性肿瘤组织的80.00%（72/90），差异有统计学意义（χ2=22.848，P＜0.01）。

2.2 上皮性卵巢癌组织中ATF-4、 SMAC蛋白表达与上皮性卵巢癌患者病理特征的关系

FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、组织学分级为G3级的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌组织中ATF-4蛋白的阳性表达率均高于FIGO分期为I～Ⅱ期、无淋巴结转移、组织学分级为G1～G2级的患者，差异均有统计学意义（χ2=6.582、5.726、7.871，P＜0.05）；FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、组织学分级为G3级的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌组织中SMAC蛋白的阳性表达率均低于FIGO分期为I～Ⅱ期、无淋巴结转移、组织学分级为G1～G2级的患者，差异均有统计学意义（χ2=7.436、8.897、10.667，P＜0.01）；不同病灶直径的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌组织中ATF-4、SMAC蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同病理特征上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌组织中ATF-4、SMAC蛋白的阳性表达情况（n=90）

3 讨论

较高的基础发病率和遗传倾向均能够促进卵巢生发上皮细胞的异常病变，加剧病情进展。具有多次流产、月经紊乱或多囊卵巢综合征的患者，其远期发生卵巢癌的风险较高[7-8]。对于卵巢癌患者病理特征的评估能够在卵巢癌的诊疗及治疗方案的制定等方面发挥作用。肿瘤蛋白或肿瘤标志物的研究能够对评估卵巢癌的病理特征提供依据。虽然血清糖类抗原19-9或糖类抗原125能够在卵巢癌的诊疗过程中发挥作用，但依靠其单独评估卵巢癌患者病理特征的局限性仍然存在，其对于卵巢肿瘤患者综合性病情评估的可靠性较低[9-11]。计算机断层扫描（CT）等影像学检查能够在卵巢肿瘤患者病情评估中发挥作用，但其滞后性较为明显。本研究通过对卵巢癌组织中ATF-4、SMAC蛋白的表达情况进行分析，旨在为卵巢癌的临床诊疗提供更为可靠的参考，提供新的研究方向和参考靶点。

ATF-4是转录调控相关因子，主要表达于转录上游启动子开放阅读区，在转录增强子的激活过程中，其过度表达能够明显促进卵巢癌细胞的异常转录。从分子机制水平进行分析，认为ATF-4对于卵巢生发上皮细胞凋亡速率的影响能够使卵巢癌细胞的凋亡比例降低。SMAC是线粒体促凋亡蛋白，主要表达于肿瘤细胞膜周边和线粒体膜周边，在肿瘤细胞能量获得或三磷酸腺苷合成过程中发挥重要的调控作用。有研究者发现，ATF-4蛋白在卵巢癌中的表达浓度明显上升[12-14]，但对于SMAC的分析不足。

本研究通过免疫组化分析可见，卵巢癌组织中ATF-4蛋白的阳性表达率明显升高，而SMAC的阳性表达率明显下降，二者在卵巢癌中存在差异性表达的趋势，这主要与ATF-4、SMAC的作用机制或转录生成调控的异常有关：ATF-4阳性表达率的升高主要与肿瘤细胞转录信号通路的激活有关，而SMAC阳性表达率的下降主要与肿瘤细胞线粒体稳定性下降导致SMAC蛋白的合成减少有关。陈雨薇等[15]发现，卵巢癌组织中SMAC蛋白的阳性表达率可下降30%以上，在卵巢癌细胞生物学行为恶化较为明显的组织中，SMAC蛋白的阳性表达率可继续下降。不同病理特征卵巢癌患者卵巢癌组织中ATF-4、SMAC蛋白的表达存在明显差异，其中，FIGO分期较晚、发生淋巴结转移、分化程度较差的卵巢癌患者卵巢癌组织中ATF-4蛋白的阳性表达率较高，SMAC蛋白的阳性表达率较低，提示ATF-4、SMAC蛋白的差异性表达与卵巢癌患者的病理特征有关。ATF-4蛋白对卵巢癌患者病理特征的影响主要在于ATF-4能够通过激活下游丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）或蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号通路，促进卵巢生发上皮细胞上皮-间充质转化；而SMAC阳性表达率的下降对于卵巢癌患者病理特征的影响主要在于其能够影响细胞器结构的稳定性，导致卵巢癌细胞的变形和浸润能力的改变，最终影响卵巢癌细胞的分化、黏附及浸润。但本研究中并未发现ATF-4、SMAC蛋白的表达对于卵巢癌细胞直径的影响，提示ATF-4、SMAC的表达并不会影响卵巢癌患者的一般性临床特征。

综上所述，卵巢癌组织中ATF-4蛋白的阳性表达率明显升高，SMAC蛋白的阳性表达率明显下降，且与卵巢癌的FIGO分期、淋巴结转移和组织学分级情况有关。ATF-4、SMAC蛋白与卵巢癌患者预后的关系有待今后进一步探索。