维生素K依赖性基质Gla蛋白与慢性肾脏病患者的血管钙化

刘 炀，向海燕，刘伦志

(湖北民族大学医学部附属民大医院 肾病内科，湖北 恩施 445000)

在慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者中，心血管疾病的患病率逐渐上升，并且与其高死亡率直接相关。心血管疾病的风险随着CKD的进展而逐渐增加。肾小球滤过率每降低10 ml/min，CKD患者发生心血管疾病猝死的风险就增加5%，而且心血管疾病是导致大约50%的终末期肾脏病患者死亡的直接因素[1]。CKD患者所伴随的这种沉重的心血管疾病负担不能仅用传统的危险因素来解释。例如氧化应激、炎症和钙/磷代谢异常等这些新发现的与尿毒症和透析有关的危险因素，已被证明可促进终末期肾脏病患者发生血管钙化(vascular calcification，VC)和心血管疾病[2-4]。VC是心血管疾病和尿毒症患者死亡的独立危险因素，在CKD早期阶段就可出现，并随着疾病的发展逐渐加重。钙在人体动脉血管壁内的沉积会导致发生心血管死亡和心血管事件的风险分别增加近4倍和3.4倍[5]。尽管VC在一个多世纪以来都被认为是一种被动性疾病，但近几年来，VC逐渐被认为是一个涉及调节蛋白和分子的活跃、持续的过程。这些蛋白和分子促进或抑制钙和羟基磷灰石在血管壁内的沉积。因此，VC应该是其抑制因子和促进因子之间失衡所导致的。在CKD患者中，VC的特征是钙化抑制因子水平的下降，常表现为血管内膜、中膜和心脏瓣膜的钙化[6]。肾脏基质Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)的表达随CKD的进展而逐渐增加，并可以预测肾脏病的预后[7]。

1 肾脏基质Gla蛋白(MGP)

1.1MGP功能的发现 MGP是由软骨和动脉壁细胞分泌的一种分子量为12 kDa的小蛋白质，包含了84个氨基酸、5个谷氨酸残基和3个丝氨酸残基。MGP是第一种在体内外被公认为VC抑制剂的蛋白，也是人体中最有效的天然钙化抑制剂[8]。此外，这种小蛋白质是唯一已知的不仅可以抑制，而且可以逆转钙化的因素。MGP的功能最早是由Luo等[9]发现的，他们使用了MGP基因被敲除的小鼠(MGP-/-)，发现它们出生6～8周后全部死于主动脉钙化。另有研究发现Keutel综合征与基因突变所导致的无功能的MGP表达有关。Keutel综合征是一种常染色体隐性遗传的罕见病，其特征是软组织和软骨过度异位钙化[10]。这一事实也提示MGP在VC预防中起着关键作用。在一项随访了7年的118名已确诊的糖尿病肾病患者的队列研究中发现，MGP T-138C(rs1800802)多态性是VC和心血管疾病死亡率的强而独立的预测因子[11]。Sheng等[12]对23项涉及5 773名对照和5 280例病例的研究进行了荟萃分析，发现MGP G-7A(rs1800801)多态性是血管内膜和中层钙化的独立预测因子。这些发现提示VC发病机制和MGP分子活化可能存在遗传基础。MGP基因的表达可以通过各种机制进行调节，这些机制有可能成为预测VC进展的基因组生物标志物[13]。

1.2MGP的活化过程和4种亚型 MGP是维生素K依赖蛋白家族的成员之一，该家族是一组涉及凝血、VC和骨代谢的17种人类蛋白[14]。所有维生素K依赖蛋白均具有无活性的谷氨酸残基，需要维生素K才能使谷氨酸的γ-羧基转化为γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate，Gla)。维生素K是MGP的羧化过程中的辅助因子，被进一步循环再用于另一次羧化。MGP因为谷氨酸转化为Gla导致分子结构和形态发生变化而被激活。此外，MGP在羧化之后，还需要进行丝氨酸残基的磷酸化后才具有生物活性。羧化是维生素K的高度依赖性反应，被认为是MGP激活中最关键的步骤。MGP只有在羧化和磷酸化之后，才能获得与钙、羟基磷灰石和骨形成蛋白2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)结合的能力，从而抑制VC[15]。因此，MGP由于其经历不同的转化方式而以各种形式存在于循环中：完全活化的羧化和磷酸化的MGP，完全未活化的未磷酸化、未羧化的MGP(dp-ucMGP)，部分活化的未磷酸化但羧化的MGP(dp-cMGP)以及部分活化的未羧化但磷酸化的MGP(ucMGP或pucMGP), 如图1。有学者研究建立了一个健康人群中总MGP的参考区间：6～108 μg/ L，认为较高的总MGP可以确定患有血管疾病的患者。Maastricht的科学团队是第一个开发出可定量ucMGP总量的特异性抗体的团队。 Roijers等[16]在尸体解剖过程中收集了12个人体冠状动脉组织，并利用质子显微镜评估了样本的微钙化组成状态。将所有动脉粥样硬化病变根据微钙化的严重程度分成了4个亚型：Ⅰ型为动脉粥样硬化前病变，Ⅱ～Ⅳ型为内膜层钙化范围逐渐扩大阶段。尽管在Ⅰ型病变中未检测到ucMGP，但在Ⅱ～Ⅳ型中ucMGP染色呈增强趋势。相反，完全羧化的MGP和BMP-2的染色在Ⅰ型中较弱，而在Ⅳ型病变中则明显增强。由此可见，羧化的MGP和BMP-2均与微钙化程度相关，MGP可能通过直接结合BMP-2来充当局部钙化的抑制因子。此外，MGP的羧化不足伴随着冠状动脉的早期亚临床微钙化[17]。

1.3dp-ucMG、维生素K和VC Schurgers等[18]通过动物模型发现，维生素K拮抗剂华法林治疗6周导致实验动物体内的MGP羧化不足，从而加快VC。由此可见，MGP需要维生素K才能具有生物活性。为了探讨是否可以通过摄入维生素K来逆转现有的VC，他们将所有大鼠分为低或高剂量的维生素K或华法林组后继续接受8周的实验。与补充维生素K的大鼠相比，华法林组的大鼠表现出VC加速，动脉粥样硬化状态增强和循环ucMGP水平明显升高。补充高剂量维生素K导致VC下降了37%。所以，维生素K介导的MGP羧化过程是激活这种强大的VC天然抑制因子的必不可少的步骤。这项研究首次表明补充维生素K可能停止、甚至逆转VC。尽管在体内、外研究中均取得了初步的结论，但基于人群的研究未能显示ucMGP与VC和心血管疾病有明确的关联[19-20]。这可能是由于测量ucMGP的方法对MGP磷酸化状态不敏感，因为它同时评估了dp-ucMGP和pucMGP。与非磷酸化相比，磷酸化形式的MGP(无论羧化状态)对结合游离钙、羟基磷灰石晶体和BMP-2的亲和力更高，因此对VC的发展具有不同的影响。另有研究发现丝氨酸残基的磷酸化是MGP活化的关键步骤[21]。特异性夹心抗体的发展使得dp-ucMGP可以与其他MGP形式分开定量，表明循环中的dp-ucMG相比pucMGP是更可靠的维生素K状态指标、更强的VC标志物和更佳的心血管疾病的预测指标[8，21-22]。

在一般人群中，dp-ucMGP与VC[23-24]、动脉张力[25]和心血管疾病[26]的各种标志物密切相关。类似的结果在以高动脉粥样硬化状态为特征的队列中(如心力衰竭和心血管疾病患者)也有报道[20，27]。由于CKD会使血管内膜和中膜以及软组织处于加速钙化的状态，因此一些研究者探讨了这些患者中dp-ucMGP与VC和心血管疾病之间的关系。 Maastricht研究小组对107名不同CKD分期的肾病患者进行了前瞻性研究，发现dp-ucMGP与主动脉钙化评分、肾功能恶化和全因死亡率密切相关[28]。在67例合并糖尿病的CKD2-5期患者队列中，dp-ucMGP随着疾病进展为终末期肾病而逐渐增高，并强烈预测了全因和心血管疾病死亡率[11]。同样，一些研究者在CKD患者中发现dp-ucMGP与各种VC标记物和肾功能之间关系密切[19，29-30]。在透析患者中，越来越多的证据表明dp-ucMGP水平与心血管疾病死亡率和发病率之间有很强的独立联系[31]。Lees 等[32]对27项研究进行荟萃分析后表明，补充维生素K虽然不能降低血管硬度，但是可以显著改善VC。

2 MGP抑制VC的主要机制

目前MGP抑制VC的机制不完全清楚，主要有以下几条作用途径：(1)结合游离钙离子。由于MGP带负电，所以它不仅对游离钙表现出高亲和力，还直接与循环中的钙分子和堆积在血管壁内的羟基磷灰石晶体结合，形成非活性复合物。MGP进一步通过吸引吞噬细胞和巨噬细胞来激活这些复合物的自噬清除[33]。MGP可以将血液循环中的游离钙清除并引导其进入骨骼内。(2)拮抗骨形态发生蛋白的作用。MGP除了作为钙螯合剂外，改善VC的另一种分子途径是下调BMP-2，这是一种众所周知的VC促进因子。BMP-2可使血管平滑肌细胞转化为成骨细胞表型。MGP通过抑制BMP-2与其受体的结合来消除BMP-2的表达。Sweatt等[34]在衰老动物模型的动脉粥样硬化血管中发现了未活化的MGP和游离活化的BMP-2(与其受体结合后)，而在无病变的动脉壁中发现了MGP与BMP-2紧密结合而成的无活性的复合物。Zhang等[35]的研究首次确定了MGP在破骨细胞的分化和功能中起着至关重要的作用，MGP可以抑制破骨细胞的分化和骨吸收。(3)结合平滑肌细胞分泌的基质囊泡。平滑肌细胞具有表型可塑性，其释放的基质囊泡可以抑制钙超载导致的平滑肌细胞分泌凋亡小体。MGP可以与平滑肌细胞分泌的基质囊泡结合抑制VC的形成。(4)抗凋亡作用。血管平滑肌细胞中的凋亡小体有利于钙结晶盐的沉积，在VC的形成过程中发挥重要重用，MGP的表达会随着凋亡小体的增长而增高，MGP在体内发挥一定的抗凋亡作用[11]。(5)与细胞外基质成分结合[36]。MGP可以与玻连蛋白和弹力蛋白这两种细胞外基质成分结合，发挥抑制VC的作用，具体机制目前尚不明确。(6)形成胎球蛋白-MGP-矿化复合物。胎球蛋白和MGP与矿物质核形成稳定的复合物，可以抑制矿物质的增长、聚集和沉积。

3 研究展望

MGP是VC强效抑制剂之一，需要维生素K才能被活化。在CKD和透析患者中，维生素K含量较低的情况已被反复证实。目前尚无关于在CKD和透析患者中补充维生素K的建议。但是，越来越多的证据表明补充维生素K可能会改善VC，以及通过激活MGP延缓心血管疾病的进展。至今还没有关于维生素K摄入的毒性或严重不良反应的报道，因此它被认为是一种安全的疗法，具有潜在的重要临床意义。所以，CKD和透析患者是否需要监测维生素K缺乏症？如果是，用什么方法？他们应该补充维生素K吗？目前，一些研究正在调查摄入维生素K是否有抗动脉粥样硬化作用。这些研究的结果可能会在这一领域有所启发，可能会建议CKD和透析患者每日适当摄入维生素K。