普萘洛尔、噻吗洛尔纳米金络合物对人血管瘤内皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

皮小雪，蔡晓琳，李梦彤，黄 铮，陈 裕，樊翌明，施 歌,2* （.广东医科大学皮肤性病学教研室，广东湛江 52400；2.中山大学附属第六医院医学美容整形中心，广东广州 50000）

婴儿血管瘤(IH)是婴儿常见的良性肿瘤，在新生儿和早产儿中的发病率分别为2.6%～4.5%、23%。多数IH在儿童早期自然消退，但出现并发症及特殊部位IH应尽早治疗[1]。中国和欧洲指南推荐口服普萘洛尔(PRO)为IH一线治疗[2-3]。局部应用噻吗洛尔(TIM)也已显示出治疗浅表和部分深层血管瘤的功效和安全性[4]，但其外用存在较多缺点，如药物渗透能力不佳、剂量难以控制、外敷纱布易脱落等。普萘洛尔系统性使用时不良反应明显，包括低血糖、低血压、心动过缓、腹泻、睡眠障碍、气道高反应性等[5]。因此，研制出新型药物制剂对IH治疗具有重要意义。鉴于纳米金可作为抗肿瘤药物载体，在抗血管新生效应中具有协同作用[6-7]。本文观察了PRO、TIM纳米金络合物对人血管瘤内皮细胞(HemECs)增殖、凋亡及细胞周期的影响，旨在探讨其对血管瘤的潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

HemECs(ATCC细胞库，北京北纳创联公司)；PRO、TIM(美国Sigma公司)；纳米金(GNR)及PRO、TIM纳米金络合物(广州珂纳偲公司)；DMEM高糖培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)；CellTiter 96 Cell Proliferation Assay试剂盒(美国Promega公司)；细胞周期和细胞凋亡测定试剂盒(上海Yeasen公司)；Annexin V/PI 双染试剂盒(美国Pharmingen 公司)；Mutiskan GO全波长酶标仪(美国Thermo公司)；FACSCanto II流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞培养及形态学观察

HemECs用含10%(体积分数)胎牛血清DMEM培养基置于37 °C、5% CO2细胞培养箱中培养，预处理后倒置显微镜观察细胞形态学变化。

1.3 计算24 h半数抑制浓度(IC50)

4.0×103/孔HemSCs接种于96孔板中培养24 h，更换新鲜培养液，每孔分别加入不同质量浓度 PRO(0、2、4、8、16、32、64、128 mg/L)、TIM(0、60、120、240、480、960、1 920、3 840 mg/L)、GNR(0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 OD) 继续培养24 h，每个质量浓度设4个复孔。加入MTS溶液(5 g/L)100 μL，37 °C、5% CO2孵育2 h，吸出上清液，酶标仪在490 nm波长处测定吸光度值，运用GraphPad Prism 7.0软件计算IC50。

1.4 MTS法检测细胞增殖率

4.0×103/孔HemSCs接种于96孔板中培养24 h，更换新鲜培养液，分为空白对照组(CTL组)、 PRO组、TIM组、GNR组、PRO+GNR(P+G)组、TIM+GNR(T+G)组，按IC50分别加入PRO、TIM、GNR、P+G、T+G，继续培养0、1、3、6、12、24、36、48 h，每组设4个复孔。按1.3中所述，检测每组细胞不同时间点增值率，绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡

0.3×106/孔HemSCs接种到6孔板，按1.4中实验组别设置、处理，胰酶消化、收集细胞，70%乙醇中固定过夜，加入RNase A溶液37 ℃处理30 min，400 μL碘化丙啶溶液4 ℃避光染色20 min。FACSC-anto II流式细胞仪分析染色细胞，Flow Jo 7.6 软件鉴定细胞凋亡率。

1.6 统计学处理

用SPSS23.0统计软件分析数据，GraphPad Prism 7.0进行作图分析。数据表示为均数±标准差，方差齐采用单因素方差分析及LSD进行检验，不齐则用Welch近似方差分析及Dunnett’s T3进行检验。

2 结果

2.1 PRO、TIM、GNR对HemECs的IC50

PRO、TIM、GNR对 HemECs的 IC50分 别 为25.46、1 081 mg/L、0.06559 OD(图1)。

2.2 HemECs形态学观察

以IC50 PRO、TIM、GNR处理HemECs 24 h，倒置显微镜发现CTL组细胞呈长梭形、纺锤状，贴壁状态良好；加药组细胞近似圆形、椭圆状，较多漂浮细胞，且细胞体积较对照组明显变小，细胞团生长受抑(图2)。

2.3 PRO、TIM、GNR及其络合物对HemECs 增殖影响

图1 PRO、TIM、GNR对HemECs细胞量效曲线图

以IC50 药物处理HemECs 1 h，MTS显示PRO、TIM、GNR、P+G和T+G组与CTL组细胞增值率差异无统计学意义(P>0.05)。在处理3、6 h，与CTL组比较，P+G和T+G组细胞增殖率下降(P<0.01)，PRO、TIM、GNR组增值率差异无统计学意义(P>0.05)。在处理12、36 、48 h，加药组细胞增殖率均低于CTL组(P<0.001或0.05)，其中P+G、T+G组更显著(P<0.001或0.01)；PRO与TIM、P+G与T+G组间细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

图3 PRO、TIM、GNR及其络合物对HemECs增殖影响

2.4 普萘洛尔、噻吗洛尔、纳米金及其络合物对HemECs细胞周期影响

以IC50药物处理HemECs 24 h，加药组与空白对照组相比，G1、S、G2期细胞数差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

2.5 PRO、TIM、GNR及其络合物及其络合物对HemECs凋亡影响

以IC50药物处理HemECs 24 h，PRO组、TIM组、GNR组、P+G组与T+G组细胞凋亡率高于CTL组(P<0.001或0.01)，其中P+R、T+R组更显著(P<0.001)；PRO与TIM、P+G与T+G组间细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(图5)。

图4 PRO、TIM、GNR及其络合物对HemECs细胞周期影响

3 讨论

我们通过MTS检测显示普萘洛尔、噻吗洛尔及纳米金处理HemECs 24 h 后IC50分别为25.46、1081 mg/L、0.06559 OD。Bota等[8]采用MTT法研究普萘洛尔处理人脐静脉内皮细胞( HUVECs)24 h后，其IC50为81.94 mg/L。Li等[9]采用MTT实验显示普萘洛尔处理血管瘤源性干细胞(HemSCs)6 h后 IC50为189.4 μmol/L。我们推测其差异可能是由于细胞株、处理细胞时间或试剂盒不同引起。此外，普萘洛尔、噻吗洛尔、纳米金及与络合物均使HemECs形态由梭形变为圆形，这与Li等[9]通过高浓度(100～400 μmol/L)普萘洛尔处理HemSCs后细胞形态变化结果是相一致的。这些进步一提示，普萘洛尔、噻吗洛尔、纳米金及其络合物对HemECs生长具有抑制作用。

图5 PRO、TIM、GNR及其络合物对HemECs凋亡影响

Huang等[10]研究表明普萘洛尔通过上调miR-125b表达抑制HemECs的增殖和促进细胞凋亡。Sun等[11]发现普萘洛尔可能通过抑制DLL4/Notch1/Akt通路抑制HemECs增殖和侵袭。大量研究报道局部使用噻吗洛尔抑制IH生长并促进其消退[12-13]。在本研究中，我们发现普萘洛尔、噻吗洛尔抑制HemECs的增殖。为进一步了解普萘洛尔和噻吗洛尔抑制HemECs增殖的可能机制，我们用流式细胞术观察普萘洛尔、噻吗洛尔作用后HemECs细胞周期及凋亡变化，发现用药组凋亡细胞比例较对照组显著增加，而细胞周期比例的差异无统计学意义。Sipkova等[14]用噻吗洛尔外敷治疗IH，1周后组织病理及透射电镜检查显示IH血管内皮细胞凋亡、血管阻塞。同样，普萘洛尔治疗的IH标本中也出现细胞凋亡[15]。普萘洛尔通过抑制细胞周期蛋白D1、CDK-4、CDK-6和磷酸化Rb表达，调控G0/G1期HemECs细胞周期停滞，进而抑制细胞增殖进展[16]。此外，多项研究表明普萘洛尔促进HemECs细胞凋亡，其机制可能通过激活内外源性凋亡通路(激活caspase-9、caspase-3，上调p53水平，增加Bax/Bcl-xL比值)[17-18]，抑制VEGF-A/VEGFR-2自分泌环介导的抗凋亡作用[19]。因此，我们推测普萘洛尔和噻吗洛尔均抑制HemECs增殖和诱导细胞凋亡，其具体机制有待进一步研究。

纳米金常作为药物载体，与抗肿瘤药物具有靶向协同作用，可提高抗血管新生效果[20]。核酸纳米金传感器可以无创监测细胞血管生成生物标志物Lrg1在血管生成中的表达[21]。纳米金联合光热疗法具有靶向抗肿瘤和抗血管生成的作用[22]。在本研究中，纳米金可抑制HemECs细胞增殖，促进凋亡，但对其细胞周期无影响。纳米金可与肝素特异性结合，阻断生长因子(如 bFGF、VEGF)与内皮细胞受体结合，进而抑制血管的生成和肿瘤生长[23]。 Song 等[24]研究表明聚乙二醇化的纳米金(PEG-GNR)可抑制血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成。此外，我们发现普萘洛尔或噻吗洛尔纳米金络合物对HemECs增殖和凋亡的作用优于单用普萘洛尔、噻吗洛尔。鉴于纳米金可作为抗肿瘤药物载体，我们推测纳米金可与普萘洛尔或噻吗洛尔发挥协同效应，增强普萘洛尔或噻吗洛尔对血管瘤细胞的抑制作用。这些结果还需要纳米金生物相容性、体内实验、动物模型等进一步验证。

综上所述，我们的结果提示普萘洛尔、噻吗洛尔、纳米金可能通过促进细胞凋亡抑制HemECs增殖，纳米金可与普萘洛尔或噻吗洛尔发挥协同效应，但具体机制有待进一步研究。