大蒜素对心肌缺血大鼠心肌组织CGRP及其受体mRNA表达水平的影响

张正升，韩贵芝，张丹丹，张 申，林 立，张兆强

缺血性心脏病是由于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，以冠心病心绞痛和急性心肌梗死最常见[1]。我国每年由突发性冠心病心绞痛和急性心肌梗死引起的死亡率高达3.2%。缺血性心脏病在我国的发病率和死亡率呈上升趋势，早期预防和控制是降低其发生的重要策略[2]。大蒜素具有降血脂、扩张血管、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血压、防治心脑血管疾病等作用[3]。近年来，国内外大量研究表明，大蒜素作用于缺血性心脏病的多个发病环节，降低冠状动脉灌注压和心脏负荷，通过低压低速灌注可防治再灌注损伤，对缺血性心脏病心肌具有保护作用，大蒜素的作用机制也成了研究的热点[4-5]。本研究旨在探讨大蒜素的心肌保护作用是否与降钙素基因相关肽(CGRP)受体mRNA表达有关，寻找大蒜素在心肌内的作用靶点，探究大蒜素对心肌缺血保护的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特异性病原菌级别(SPF)10～12周龄Wester大鼠80只，雌雄各半，体重(230±20)g。由济宁医学院实验动物中心提供。

1.2 主要仪器与试剂 大蒜素(上海源叶生物科技有限公司)；台式大容量冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；YXQ602型电热式蒸汽消毒器(山东新华器械股份有限公司)；Arktik5020型多功能PCR仪(赛默飞世尔科技公司)；实时荧光定量PCR仪(美国伯乐CFX96)；PCR8联管(无锡国盛生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠心肌缺血模型 腹腔注射异丙肾上腺素(3 mg/kg)，每日2次，上午、下午各1次，连续3周，制造大鼠急性心肌缺血模型。通过检测心电图、血清肌钙蛋白含量确定心肌缺血模型是否构建成功。对照组注射等量的生理盐水。

1.3.2 分组和处理方法 将模型大鼠按照完全随机化原则分为4组：大蒜素高、中、低剂量组和模型组，每组12只；另取12只正常大鼠作为正常对照组。高、中、低剂量组分别灌胃大豆油配制的400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg浓度的大蒜素，模型组和对照组灌胃等容量的大豆油，等容灌胃量0.1 mL/10 g。

1.4 指标测定方法

1.4.1 组织形态学观察 取左心室心尖处心肌组织1～2 mm，放在4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，电光镜观察大鼠左心室心肌组织的病理变化。

1.4.2 血清和心肌组织中CGRP含量 摘眼球取血，离心取血清，解剖取心脏，制备心肌组织匀浆液，严格按试剂盒说明操作，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清和心肌组织中CGRP含量。

1.4.3 心肌细胞总RNA 染毒试验结束后，取各组大鼠心肌组织，研磨，用生理盐水洗涤3次。采用Trizol试剂抽提细胞总RNA，操作步骤根据说明书进行。

1.4.4 引物和内参的设计 从美国国家生物信息中心(NCBI)获取大鼠CGRP 受体mRNA的基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司设计CGRP受体 mRNA引物。详见表1。

1.4.5 CGRP受体mRNA荧光定量PCR的产物电泳 将提取出的总RNA电泳分离CGRP受体mRNA，将扩增产物进行PCR扩增，进行实时荧光定量分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 在建立模型的过程中，大鼠毛色发暗，精神状态较差，大部分大鼠粪便不成形，稀、软粪便黏到笼壁和笼底。灌胃大蒜素后，大蒜素各剂量组大鼠的精神状态日渐好转，较模型组大鼠更活跃，灌胃过程中模型组大鼠出现感冒、打喷嚏等症状，大蒜素各剂量组和对照组大鼠未出现感冒、打喷嚏等症状，表现出较强的抵抗力。

2.2 大鼠心肌组织病理变化 正常对照组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞排列均匀，细胞充盈；模型组心肌纤维溶解无规则，心肌细胞空泡化，大量噬碱性细胞和炎性细胞浸润；大蒜素各剂量组炎性细胞减少，心肌纤维排列较规律。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理切片HE染色(×400)

2.3 各组大鼠血清和心肌组织中CGRP含量比较 大蒜素各剂量组与模型组心肌CGRP水平均低于正常对照组(P<0.05)。与模型组比较，大蒜素中、高剂量组心肌组织中CGRP含量升高(P<0.05)。各组血清中CGRP含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

组别只数血清CGRP心肌CGRP正常对照组 1241.56±1.9955.15±1.67 模型组 1227.56±4.3748.65±3.40①大蒜素低剂量组1230.43±2.0050.35±2.44①大蒜素中剂量组1239.09±2.8151.85±3.21①②大蒜素高剂量组1239.78±7.5152.05±4.12①②F值1.6789.268P0.1770.000

与正常对照组比较， ①P<0.05；与模型组比较， ②P<0.05。

2.4 PCR羧基荧光素检测 对提取的总RNA进行荧光PCR扩增，通过对CGRP mRNA反应的扩增曲线和溶解曲线进行分析表明，mRNA浓度对数值和循环阈值之间呈正相关线性关系。详见图2、图3。

图2 CGRP受体 mRNA扩增曲线

图3 CGRP 受体mRNA溶解曲线

2.5 各组大鼠心肌组织CGRP 受体mRNA表达水平比较 各组大鼠心肌组织CGRP受体mRNA表达水平差异有统计学意义(F=5.800，P=0.001)。与正常对照组比较，大蒜素各剂量组心肌组织CGRP受体mRNA表达水平均降低(P<0.05)；大蒜素低剂量组、中剂量组CGRP受体 mRNA表达水平较模型组增高(P<0.05)。表明一定剂量的大蒜素可以在一定范围内提高CGRP 受体mRNA的表达水平，改善和缓解心肌供血，但不能恢复到正常水平。详见表3。

组别只数CGRP受体mRNA正常对照组 121.32±1.24 模型组 120.55±1.54①大蒜素低剂量组120.78±0.24①②大蒜素中剂量组120.82±0.48①②大蒜素高剂量组120.59±0.26①F值5.800P0.001

与正常对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<

0.05。

3 讨 论

CGRP是一种短链活性生物多肽，由37个氨基酸组成，广泛分布于周围和中枢神经系统内，是一种活性很强的扩血管物质，其扩血管作用强于乙酰胆碱、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)等，CGRP功能多样，有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞凋亡和增殖等功能[6-7]。国内外研究表明，大蒜素对心肌的作用机制主要包括大蒜素可有效清除超氧阴离子自由基，抗脂质过氧化反应；促进扩张血管物质产生，如一氧化氮(NO)、硫化氢(H2S)、一氧化氮合成酶(NOS)；在高浓度下抑制心房心肌细胞内钙超载钙拮抗等作用；延缓心肌细胞凋亡；使心室肌细胞钙电流-电压曲线明显上移，抑制心肌细胞L-型钙通道等[8-14]。大蒜素对心肌收缩力的影响仍存在争议。

本研究结果表明，一定剂量的大蒜素可以提高大鼠心肌组织中CGRP受体 mRNA表达水平，增加血管平滑肌细胞、血管内皮细胞中CGRP受体的表达，增强CGRP对心肌血管平滑肌和血管内皮细胞的扩血管调控保护作用，改善缺血心肌的供血，但是不能恢复到正常水平，能够为大蒜素预防和缓解缺血性心脏病提供理论依据。