猪链球菌2型临床分离株的分离鉴定和生物学特性分析

夏 叶，郑琳琳，李春华，郭佳宏，凌红丽，蒋贻海，缪德年*

(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海市农业科学院上海种猪工程技术研究中心，上海 201106；3青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛 266001)

猪链球菌病(swine streptococcosis)是一种重要的人畜共患传染病，会引起猪脑膜炎、关节炎、败血症、流产及仔猪突然死亡等[1]，人通过接触污染的生肉产品或患病动物而引发感染，严重者会发生中毒性休克甚至死亡[2]。该病不仅危害养猪业的发展，也对从业人员的健康造成威胁，危害公共卫生安全。猪链球菌(Streptococcussuis)是引起猪链球菌病的病原菌，该菌为革兰氏阳性菌，兼性厌氧。根据荚膜多糖抗原的不同，猪链球菌分为35个血清型：1—34型及1/2型。其中猪链球菌2型流行最广、毒力最强，是最易引发人和动物感染的血清型[3-4]。

不同猪链球菌菌株之间的致病力存在显著差异，这种差异可能与菌株的毒力基因分布有关。猪链球菌的主要毒力基因包括谷氨酸脱氢酶gdh(glutamate dehydrogenase)、溶菌酶释放蛋白mrp(muramidase-released protein)、胞外因子epf(extracellular protein factor)、溶血素sly(suislysin)、荚膜多糖cps(capsular polysaccharide)、毒力相关序列orf2(virulent-assocciated sequence)以及纤连蛋白原结合蛋白fbps(fibronectin-binding proteins)[5-6]。不同地区分离株的毒力基因分布具有差异性。gdh基因存在于所有的猪链球菌菌株中，且GDH蛋白在抗原性上具有较好的种属特异性，可作为检测猪链球菌的标识[7]。本研究拟通过PCR和生化方法鉴定分离株及其毒力基因分布，并对该分离株进行耐药性检测，以期为临床防治、监管和治疗猪链球菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基购自英国Oxoid有限公司；血平板和革兰氏染色液购自广东环凯生物有限公司；细菌微量发酵管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；2×Taq MasterMix、DNA Marker和DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Gold View核酸染料购自北京赛百胜生物技术公司。

1.2 病料来源

病料组织采集于江苏某大型规模化猪场中典型发病仔猪的关节液及脑脊液。

1.3 病原菌的分离培养

无菌采集发病仔猪的关节液和脑脊液，接种至TSA血平板，37℃培养24h后观察细菌的培养情况。挑取典型单菌落接种至TSB液体培养基，37℃摇床培养12h。将纯培养的细菌进行革兰氏染色、镜检，并对阳性菌进行传代纯化。

1.4 生化试验

将纯培养的细菌接种于微量发酵管内，37℃培养24 h，观察其产酸、产气的生化反应。

1.5 引物设计与合成

参照Tang等[8]的报道，合成猪链球菌管家基因gdh和重要毒力基因sly、epf、mrp的引物序列，鉴定该分离株是否为猪链球菌。参照Smith等[9]的报道，合成猪链球菌1型和2型分型基因cpsI1和cps2J的引物，进行分型鉴定。引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 PCR反应引物

1.6 基因组DNA的提取

过夜培养的细菌经PBS洗涤后离心收集菌体，按照DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA待用。

1.7 管家基因及血清分型鉴定

以上述DNA为模板，进行管家基因gdh以及分型基因cpsI1和cps2J的PCR扩增。PCR反应体系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O补齐至总反应体系为20 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.8 毒力基因检测

以上述DNA为模板，进行3种主要毒力基因的PCR扩增。PCR反应体系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补齐至总反应体系为20 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.9 药敏检测

采用药敏试纸扩散法进行分离株的药敏试验。将过夜培养的分离株液体培养物均匀涂布于TSA血平板，将药敏试纸贴于血平板上，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径，根据药敏试纸说明书对分离株的药敏结果进行判定。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离

分离菌在血平板上呈现直径0.1—1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐的圆形小菌落，呈 α 溶血(图1A)；革兰氏染色为阳性，菌落呈单个、成对或短链存在(图1B)，命名为HA21。

2.2 生化试验

该分离株能发酵果糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖产酸，为阳性反应；发酵蔗糖、麦芽糖、山梨醇、阿拉伯糖不产酸，为阴性反应，与猪链球菌的生化反应结果相符。

2.3 管家基因及血清分型鉴定

PCR结果显示：该分离株管家基因gdh的鉴定结果为阳性(图2)，确定该分离菌为猪链球菌；分型基因cpsI1鉴定结果为阴性，cps2J鉴定结果为阳性，确定该分离菌为猪链球菌2型(图3)。

2.4 毒力基因分布分析

采用PCR方法检测到该分离株主要毒力基因的分布情况为sly+/mrp+/epf+(图4)。其中，目的片段Sly的条带大小为248bp，mrp的条带大小为885bp，epf的条带大小为442bp，与预期相符。

2.5 药敏检测结果

该分离株对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢拉定、先锋霉素、氧氟沙星敏感，对庆大霉素、环丙沙星中度敏感，对卡那霉素、壮观霉素、阿奇霉素、林可霉素、链霉素、红霉素不敏感。

3 讨论

猪链球菌病是危害我国养猪业的重要细菌性疾病之一。近年来，猪链球菌病多次在国内暴发，特别是四川、江苏、广东等养殖大省[10-11]，造成重大经济损失，危害公共卫生安全。在35种猪链球菌血清型中，1型、1/2型、2型、7型、9型和14型为主要血清型，目前我国最流行的血清型为猪链球菌2型，多次爆发的疫情均为2型感染[12]。本研究中分离得到的菌株经形态、生化试验和PCR鉴定，确定为猪链球菌2型。

Vecht等[13]认为，虽然猪链球菌存在多种毒力相关因子，但sly、mrp和epf这3个毒力基因被认为是判定猪链球菌2型毒力强弱的指标。一般认为强毒株的毒力基因分布为mrp+/sly+/epf+，从发病猪体内分离得到的菌株普遍为强毒株；而弱毒株的毒力基因分布为mrp-/sly-/epf-，从健康猪体内分离得到的菌株通常为弱毒株。然而，近几年Gottschalk等[6]从发病猪体内分离得到的多个猪链球菌2型分离株的毒力基因分布表现为mrp-/+/sly-/epf-。Dong等[14]发现mrp+的分离株也存在低毒力表型，而mrp-也存在高毒力表型。本研究中的猪链球菌为从病死猪体内分离得到，其毒力基因分布为sly+/mrp+/epf+，推断该分离株HA21可能为强毒株。

目前，对猪链球菌病的治疗和预防手段主要是抗生素防治。但随着抗生素的使用越来越广泛、剂量越来越大，菌株的耐药性也随之增高，导致利用抗生素防控猪链球病的难度越来越大。本研究通过对临床分离的猪链球菌HA21进行药敏分析，发现其对青霉素、阿莫西林、头孢拉定等β-内酯酰胺类抗生素敏感；对卡那霉素、链霉素、红霉素等抑制细菌蛋白质生物合成的抗生素耐药性严重。因此，该猪场对猪链球菌病的用药应以青霉素为主，头孢类药物为辅，选择性的轮换用药，避免产生抗生素耐受。定期的药敏检测可避免饲养过程中的抗生素滥用，指导发病时的临床用药，并防止耐药菌株甚至超级细菌的产生。由于猪体的耐药基因可通过接触或食物链等方式传递给人类，因此对菌株的耐药性监测不仅对猪场的疾病防治具有指导作用，对人类及公共卫生安全也有重大意义。