离子液体-超声波协同法提取黑豆异黄酮及抗氧化性研究*

黎 莉，于德涵，苏 适，王广慧

(绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

黑豆(Glycinemax(L.)Merr.)源产于中国，与大豆同属豆科植物[1]。黑豆中的异黄酮是普通大豆的5～7倍[2]，具有类雌激素样、预防心血管病、抗肿瘤以及抗骨质疏松等生理活性，可作为预防和治疗多种疾病的保健品和药物[3-6]，在医药领域发挥着不可替代的作用。目前，超声波法提取中药材能加强有效成分的溶出，提高提取率[7]。离子液体作为提取剂，具有环境友好、选择性高、萃取范围广等优点，弥补常规方法的不足。本研究首次采用响应曲面法优化离子液体-超声波辅助提取黑豆异黄酮的提取工艺，为黑豆异黄酮相关产品的开发和进一步研究提供参考。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

青仁黑豆：购自农贸市场。

金雀异黄酮标准品(纯度 98%)，中国药品生物制品检定所；[Bmim]BF4(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐)、[Bmim]Cl (1-正丁基-3-甲基咪唑氯)、[Emim]Br(溴化-1-乙基-3-甲基咪唑)[Bmim]Br(溴化-1-丁基-3-甲基咪唑)、[Omim]Br(溴化-1-己基-3-甲基咪唑),纯度均为97%，阿尔法试剂有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析纯)，美国 Sigma 公司；抗坏血酸(分析纯)，天津市福晨化学试剂厂；无水乙醇(分析纯)，国药试剂有限公司。

1.1.2 仪器设备

DL-1000E超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；小型高速粉碎机，无锡久平仪器有限公司；VIS-721紫外分光光度计， 渡扬精密仪器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 标准曲线

参考文献方法[8]，准确称取染料木素标准品1.0 mg，用95%的乙醇制成浓度为 1 mg/mL的标准溶液，分别量取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL的标准溶液，置于10 mL的容量瓶中定容，在 260 nm处测吸光度。以浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程Y=0.1126x，R2=0.9979。

1.2.2 黑豆异黄酮的提取

黑豆粉碎→过60目筛→正己烷，脱脂 2 次→离子液体-超声提取→提取液离心→含量测定。

1.2.3 提取量的计算

按1.2.1项下方法测定其吸光度，并根据回归方程，计算黑豆异黄酮的提取量。

(1)

式中：R为异黄酮提取量，mg/g；C为测得浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；n为稀释倍数；M为原料质量，g。

1.2.4 提取工艺优化

准确称取已脱脂的黑豆粉末2.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆异黄酮，采用0.8 mol/L的[Bmim]BF4、[Bmim]Cl、[Emim]Br、[Bmim]Br、[Omim]B五种离子液体为提取溶剂，离子液体浓度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol·L-1)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g·mL-1)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、超声功率(200、250、300、350、400 W)对黑豆异黄酮提取量的影响。

1.2.5 响应面实验设计

根据单因素实验，选择离子液体浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)、提取温度(D)，以异黄酮提取量为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，建立响应回归模型，因素水平见表1。

2 结论与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 离子液体浓度对提取量的影响

由图1可知，黑豆异黄酮的提取量随离子液体浓度增大而增加，当离子液体浓度超过0.6 mol/L时，提取量开始下降。可能是离子液体浓度小，离子液体与异黄酮分子接触概率低，故提取量低；但是离子液体的浓度过高，会增大溶液的黏度，很难渗入到细胞的内部，降低了对异黄酮的溶出[9]。因此，选择离子液体浓度 0.6 mol/L。

图1 离子液体浓度对提取量的影响

2.1.2 提取时间对提取量的影响

图2 提取时间对提取量的影响

由图2可知，异黄酮的提取量随提取时间的延长而增加，当提取时间超过50 min时，提取量开始下降。可能是提取时间过短，异黄酮不能充分浸出。在超声波空化作用和机械震动的持续作用下，延长提取时间异黄酮溶出增加，提取量升高。但细胞内的胶质和色素、蛋白等成分也会同时溶出，提取量下降[10]。因此，超声时间选择50 min。

2.1.3 料液比对提取量的影响

图3 液料比对提取量的影响

由图3可知，黑豆异黄酮的提取量随料液比的增大而增加，当料液比超过1:25(g/mL)时，提取量开始下降。可能是料液比过小，离子液体粘度较大，不利于异黄酮的溶出。料液比超过1:25(g/mL)，溶剂会对超声波有一定的吸收效应，对异黄酮溶出作用减弱，提取量降低[11]。因此，料液比选择1:25(g/mL)。

2.1.4 超声功率对提取量的影响

图4 超声功率对提取量的影响

由图4可知，超声波功率从200 W 增长到350 W时，异黄酮的提取量明显增加，但功率大于350 W后，提取量开始下降。可能是超声波会导致植物细胞运动加剧，加速了异黄酮的释放；但超声功率过高会破坏异黄酮的分子结构[12]，提取量下降。因此，超声功率选择350 W。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计及结果

表2 响应面实验设计方案

续表2

24-10015.08825-10105.0152611004.017270-1014.65828-100-14.592290-10-13.753

2.2.2 响应面的建立与分析

采用Design-Expert8.0软件对表2中的数据进行分析，以黑豆异黄酮提取量(Y)为响应值，得到各因子的二次回归拟合方程为：

Y=0.65+0.070A+0.037B+6.167×10-3C+0.047D+0.044AB+0.030AC-0.022AD-0.018BC-0.061BD+0.069CD-0.089A2-0.086B2-0.13C2-0.023D2

表3 方差分析表

注：p>0.05为不显著；p<0.05为显著；p<0.01为极显著。

2.2.3 响应面分析

采用Box-Behnken 软件对离子液体浓度、提取时间、液料比和提取温度之间两两交互作用关系进行分析。响应曲面坡度越陡峭，表明黑豆异黄酮提取量对于操作条件的改变越敏感；反之，如果响应面坡度越平缓，说明提取因素的改变对响应值越不敏感。图5中各因素相互作用得到的等高线均为椭圆形。由图5(a)可知，离子液体浓度和料液比对黑豆异黄酮提取量的交互作用极显著，当离子液体浓度为 0.57 mol/L，料液比为1:21时，异黄酮提取量达到最大；从等高线图可知，离子液体浓度对异黄酮提取量影响比超声时间更为显著。由图5(b)可知，提取时间和料液比对黑豆异黄酮提取量的交互作用极显著，当超声时间为40 min，料液比为1:21时，异黄酮提取量达到最大；从等高线图可知，提取时间对异黄酮提取量影响比料液比更为显著。实验结果与模型的方差分析结果一致。

图5 等高线及响应曲面图

2.2.4 验证实验

结合单因素实验，分析回归模型，经过验证，最终得出该提取方法准确可靠。黑豆异黄酮的最佳提取条件：离子液体浓度0.57 mol/L，提取时间40.16 min，料液比1:21.65，超声功率度357 W，理论预计值6.14 mg/g。考虑实际操作，选择离子液体浓度0.57 mol/L，提取时间40 min，料液比1:21，超声功率度350 W，进行5次平行实验，平均值为0.611%，与预测值0.614%接近，说明预测模型与实际情况拟合较好。

3 结 论

本文首次采用离子液体-超声辅助法提取黑豆异黄酮，得到最佳工艺条件为：离子度0.57 mol/L，提取时间40 min，料液比1:21，超声功率度350 W，在此条件下黑豆异黄酮的提取量可达6.11 mg/g。采用离子液体为提取剂较传统提取方法有很大的提高[8-9]，缩短了提取时间，所需溶剂少，离子液体可重复利用，是一种快速高效提取黑豆异黄酮的理想方法。