柴胡皂苷A对糖尿病大鼠肾结构和功能的保护作用及机制研究

张晓利， 胡威利， 吴银， 孙昆， 周一龙， 路芳

（1.新乡医学院第三附属医院肾病风湿科，河南新乡 453000；2.新乡医学院第三附属医院血液净化室，河南新乡 453000）

长期处于高糖状态下的肾脏损害是糖尿病最常见的微血管并发症，其肾功能往往损伤严重[1]，约30%的1型糖尿病将发展成终末期肾病[2]。因此，防治糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者的肾脏损害具有重要的研究意义。柴胡是常用传统中药材之一，味苦，性微寒，入肝胆经，具有和解少阳、疏肝解郁、升阳的功效。其主要成分柴胡皂苷A（saikosaponin A）是一种具有多种药理活性的三萜皂苷，具有保肝、护肾、抗炎、抗病毒、抗癫痫、抗抑郁、抗癌和抗氧化等作用[3-10]。既往研究发现，氧化应激、高血糖、糖基化终产物的产生和多种信号通路在糖尿病肾病的发病机制中起着至关重要的作用[11-13]。基于此，本研究建立糖尿病大鼠和高糖诱导的肾小管上皮细胞模型，探讨柴胡皂苷A对糖尿病模型大鼠的疗效及保护其肾结构和功能的机制，以期为临床应用柴胡皂苷A干预糖尿病肾病提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物50只SPF级SD雄性大鼠，体质量为180～220 g，购自北京维通利华公司，动物质量合格证号：SCXK（京）2015-0001。于河南省新乡市精神生物病学重点实验室SPF级别动物饲养房饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（豫）2014-0000。

1.2细胞大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E购自中国科学院。用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、体积分数5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.3药物与试剂柴胡皂苷A（分子式：C42H68O13；分子量：780.98；纯度：HPLC998%；批号：SS8020）购自北京索莱宝公司，经二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成母液，-20℃避光保存。二甲双胍（metformin），购自中国食品药品检定研究院。DMSO、苏木素—伊红（HE）染色试剂盒，购自北京索莱宝公司；胎牛血清、杜尔贝科改良培养基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）、链脲佐菌素干粉，购自美国Sigma公司；TRIzol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒，购自美国ThermoFisher公司；血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、尿蛋白（UP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；兔源异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和沉默信息调节因子3（SIRT3）、GAPDH单克隆抗体及二抗，购自美国Abcam公司。

1.4主要仪器雅培安妥血糖仪及试纸（美国雅培公司）；PCR仪、电泳仪及半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统（广州云星仪器有限公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；低温离心机（美国IEC公司）；普通光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.5动物实验

1.5.1 动物分组、造模及给药 大鼠适应性饲养7 d后，随机分为6组，即正常组、模型组、柴胡皂苷A低剂量组（5 mg/kg）、柴胡皂苷A中剂量组（10 mg/kg）、柴胡皂苷A高剂量组（20 mg/kg）[14]和二甲双胍组（350 mg/kg）[15]，每组6只。采用高脂喂食结合化学诱导法建立糖尿病大鼠模型[16-17]，方法：除正常组之外，其他各组大鼠分别喂食高脂饮食4周后，一次性腹腔注射用pH 4.5枸橼酸缓冲液溶解配制成的链脲佐菌素（30 mg/kg）0.1 mL，构建糖尿病大鼠模型；而正常组喂食普通饲料4周后，一次性腹腔注射0.1 mL枸橼酸缓冲液。72 h后，大鼠尾静脉空腹取血测定血糖值，血糖值若超过11.1 mmol/L则判断造模成功，即可用于后续实验。造模成功后，各给药组分别对应给予药物灌胃，正常组和模型组给予等容量生理盐水灌胃，每天给药1次，连续28 d。

1.5.2 肾功能指标24 hUP、SCr、BUN检测 按照24 hUP、SCr、BUN测试盒说明方法，应用可见分光光度计在595 nm波长处测24 hUP吸光度值，在546 nm波长处测SCr吸光度值，在640 nm波长处测BUN吸光度值。

1.5.3 肾脏肥大指数 称取大鼠双侧肾质量及体质量计算肾脏肥大指数，肾脏肥大指数=双肾质量（m/mg）/体质量（m/g）。

1.5.4 HE染色法观察大鼠肾脏病理损伤情况 大鼠肾组织经体积分数10%福尔马林溶液充分固定，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋后，制作成约4μm厚度的病理切片，再根据HE染色试剂盒说明书进行HE染色。在光学显微镜下观察各组大鼠肾脏组织的病理变化。

1.5.5 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测肾脏组织氧化应激因子SOD、GSH-Px活性及MDA含量 收取大鼠肾脏组织匀浆液上清，根据SOD、GSH-Px、MDA ELISA试剂盒说明书，应用酶标仪于450 nm波长处测定SOD吸光度值，采用可见分光光度计于420 nm波长处测GSH吸光度值，于532 nm波长处测定MDA吸光度值。

1.5.6 逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表达 用TRIzol试剂提取肾脏组织总RNA，并使用反转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green PCRMaster试剂盒进行PCR。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。72℃延长10 min。反应结束后加做熔解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和熔解曲线结果进行PCR定量标准曲线的制作。引物序列：IDH2（forward：5’-AATTAGCC CCGTCTG-3’； reverse：5’-GGGGAGAGAGAGA GACATTGAA-3’），扩增片段长度为98 bp。MnSOD（forward：5’-AAGGAGCAGGTCTTAGCAGA-3’；reverse：5’-CAAATGGGCTAGTAGTCAGGTC-3’），扩增片段长度为285 bp。SIRT3（forward：5’-GCT GACGACTTCGACGACG-3’；reverse：5’-TCGGT CAACAGGAGGTTGTCT-3’），扩增片段长度为130 bp。

1.5.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3表达 用含蛋白抑制剂的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解大鼠肾脏组织提取总蛋白，4℃离心收集上清，用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移蛋白质到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L脱脂奶粉室温封闭蛋白质2 h后，分别加入IDH2、MnSOD、SIRT3、GAPDH等一抗（稀释度为1∶800）4℃孵育过夜。弃去一抗，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。以化学发光法于暗室曝光显影。应用Image J软件统计灰度值，结果以目的蛋白与GAPDH内参蛋白的灰度值比值表示。

1.6细胞实验

1.6.1 细胞模型 待NRK-52E细胞生长至融合状态后，将细胞分为正常组、高糖组、柴胡皂苷A 5μmol/L组、柴胡皂苷A 10μmol/L组、柴胡皂苷A 20μmol/L组[18]。其中：正常组培养基含5.6 mmol/L葡萄糖，高糖组、柴胡皂苷A 5μmol/L组、柴胡皂苷A 10μmol/L组、柴胡皂苷A 20μmol/L组培养基含30 mmol/L葡萄糖[19]，分别刺激24 h。

1.6.2 ELISA法检测细胞MDA、SOD、GSH-Px含量 收取各组NRK-52E细胞培养液上清，具体检测步骤同“1.5.5”项。

1.6.3 RT-PCR法检测细胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表达 用TRIzol试剂提取细胞总RNA，后续具体检测步骤同“1.5.6”项。

1.6.4 Western Blot法检测细胞IDH2、MnSOD、SIRT3蛋白表达 用含蛋白抑制剂的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解NRK-52E细胞提取总蛋白，后续具体操作步骤同“1.5.7”项。

1.7统计方法采用SPSS18.0统计软件对所有实验数据进行分析，数据结果以均数±标准差（-x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析进行检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和肾脏肥大指数比较图1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和肾脏肥大指数均显著增加（P＜0.01）。表明该糖尿病模型大鼠存在肾功能损害。与模型组比较，柴胡皂苷A中、高剂量组和二甲双胍组大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和肾脏肥大指数均下降（P＜0.05或P＜0.01），且3个治疗组大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和肾脏肥大指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A可有效减轻糖尿病大鼠肾功能损伤，并具有剂量依赖性。

图1 各组糖尿病大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和肾脏肥大指数比较（±s，N=6只）Figure 1 Comparison of the levels of 24 hUP，SCr and BUN，as well as renal mass index in various groups（±s，N=6）

2.2各组大鼠肾脏病理改变比较图2结果显示：正常组大鼠肾脏组织肾小球体积正常，未见系膜细胞增生，肾小管间质区结构清晰，细胞排列紧密、胞浆丰富；模型组大鼠肾脏组织肾小球体积明显增大，系膜基质增多，肾小管肿胀、空泡样变性，伴有炎性浸润等；各给药组大鼠肾组织病变均较模型组减轻，其中，柴胡皂苷A中、高剂量组和二甲双胍组仅见肾小管细胞轻度肿胀、空泡样变性。

图2 各组糖尿病大鼠肾脏病理改变比较（HE染色，×200；N=6只）Figure 2 Comparison of the rat renal pathological changes in various groups（by HEstaining method，×200；N=6）

2.3各组大鼠肾脏组织SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较图3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性显著下降，MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡皂苷A中、高剂量组和二甲双胍组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05或P＜0.01），且3个治疗组大鼠肾脏组织SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有有效促进糖尿病大鼠肾脏组织抗氧化酶活性、减少脂质过氧化物生成进而抑制氧化应激反应的作用，且呈剂量依赖性。

图3 各组糖尿病大鼠肾脏组织SOD、GSH-Px活性，MDA含量比较（±s，N=6只）Figure 3 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

图4 各组糖尿病大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达比较（±s，N=6只）Figure 4 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

2.4各组大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达比较图4结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均降低（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡皂苷A中、高剂量组和二甲双胍组大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均升高（P＜0.05或P＜0.01），且3个治疗组大鼠肾脏组织IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有增强糖尿病大鼠肾脏组织抗氧化能力的作用，且呈剂量依赖性。

2.5各组大鼠NRK-52E细胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较图5结果显示：与正常组比较，模型组NRK-52E细胞SOD、GSH-Px活性显著下降，MDA含量显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡皂苷A 10、20μmol/L组NRK-52E细胞中SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量减少（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有有效促进高糖诱导的肾小管上皮细胞抗氧化酶活性、减少脂质过氧化物生成进而减轻氧化应激损伤的作用，且呈剂量依赖性。

2.6各组大鼠NRK-52E细胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达比较图6结果显示：与正常组比较，模型组NRK-52E细胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均降低（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡皂苷A 10、20 μmol/L组NRK-52E细胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有增强高糖诱导的肾小管上皮细胞抗氧化能力的作用，且呈剂量依赖性。

3 讨论

糖尿病肾病是一种严重的糖尿病微血管并发症，主要病理变化表现为肾小球滤过率增加，伴随肾小球肥大和硬化、肾小管萎缩和间质纤维化及系膜增生等病理改变，临床上以持续的蛋白尿和肾功能进行性下降为主要表现[20]。早期预防和治疗十分必要。

图5 各组NRK-52E细胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较（±s）Figure 5 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in NRK-52E cells of various groups（±s）

图6 各组NRK-52E细胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表达比较（±s，n=3）Figure 6 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in NRK-52E cells of various groups（±s，n=3）

为观察糖尿病大鼠肾结构和功能变化，本研究采用高脂喂食结合化学诱导法构建了糖尿病大鼠模型。结果显示：模型组大鼠肾脏功能指标24 hUP、SCr、BUN水平升高，肾脏肥大指数增加，肾脏组织可见肾小球体积明显增大，系膜基质增多，肾小管肿胀、空泡样变性，伴有炎性浸润等，表明糖尿病大鼠出现不同程度的肾结构和功能损害。经柴胡皂苷A干预后，糖尿病大鼠肾脏功能指标24 hUP、SCr、BUN水平降低，肾脏肥大指数降低，受损的肾组织得到明显改善。表明柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠肾脏病理损伤，从而调节糖尿病大鼠的肾脏功能。

既往研究表明，氧化应激是包括糖尿病在内的多种慢性疾病及并发症的机制之一[21-22]。Sirtuins是保守的III类组蛋白脱乙酰基酶家族，SIRT3是该家族中调控细胞增殖和氧化应激的关键调节因子，可通过去乙酰化激活超氧化物歧化酶2（SOD2）和叉头框转录因子O3（FOXO3）的转录表达来保护细胞免受氧化应激损伤、减轻氧化应激导致的线粒体功能障碍[23-25]。IDH2和MnSOD是线粒体内的抗氧化酶，SIRT3可作用于两者，进而打破细胞内活性氧簇（ROS）稳定，SIRT3的表达缺失将直接导致活性氧簇蓄积，使葡萄糖摄入增加和线粒体氧化转化[26-27]。本研究结果显示，糖尿病模型大鼠和高糖诱导的肾小管上皮细胞模型SOD和GSH-Px活性，IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表达水平均较正常组降低，MDA含量升高。柴胡皂苷A在糖尿病模型大鼠和高糖诱导的肾小管上皮细胞模型中上调IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表达，增加抗氧化酶（SOD和GSH-Px）活性、降低组织和细胞中氧化产物（MDA）的蓄积，从而改善糖尿病大鼠肾脏组织线粒体功能和高糖摄取，最终改善糖尿病大鼠的肾脏病理学改变和肾脏功能。

综上所述，柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠肾结构和功能损伤，其机制可能与其增强高糖状态下肾小管上皮细胞的抗氧化能力、减轻氧化应激反应有关。下一步我们将研究柴胡皂苷A对糖尿病肾病中抗氧化信号通路的调节作用。