超声辅助提取夏枯草中的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷

冯春特, 黄伊嘉, 杨磊*, 莫开林*

1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，黑龙江 哈尔滨 150040；

2. 四川省林业科学研究院，四川 成都 610081

夏枯草（Prunella vulgaris L.）为唇形科夏枯草属植物，是一种重要的多年生药用植物，在全国各地均有分布，主产于四川、陕西、甘肃、江苏、浙江、安徽、河南等省，国外主要分布在欧洲、北非、西亚、印度、北美洲等地[1]。夏枯草作为一种传统的中药，在中国有多年的使用历史。传统的中医学理论认为夏枯草味道苦涩而且辣性冷，具有消肿、抗发热和镇静的作用[2,3]。现代临床研究表明，夏枯草具有广泛的生物学效应，包括抗病毒、抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性[4-7]。除药用外，夏枯草也被应用于凉茶和食品中[8]。

研究表明，夏枯草中含有多种类型的化学成分，目前从中已分离出萜类、甾醇类、酚酸类、黄酮类、挥发油及糖类等多种化学成分[9]。迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（Rosmarinic acid-3-O-glucoside）作为夏枯草的特征成分[10,11]，已被人们广泛研究。药理学研究表明，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷都具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等[12-14]。

超声细胞破碎辅助提取是近些年来发展起来的新技术，拥有操作简单，提取时间短和溶剂消耗少的特点，已经成功应用于很多中药植物活性成分的提取[15]。本实验将超声探头直接接触植物组织与提取溶剂，对夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的提取工艺进行研究，为中药夏枯草资源的深度开发提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

夏枯草购于安徽亳州市大西北药业有限责任公司，经东北林业大学谷会岩教授鉴定，用粉碎机粉碎，过60～80 目备用。

迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（纯度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色谱级，赛莫非世尔科技(中国)有限公司），乙醇（分析级，天津市天士力化学试剂有限公司）。

高效液相色谱仪（安捷伦Agilent 1260），超声波细胞破碎仪（型号JY92-IID）。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC 色谱条件及标准曲线的绘制

对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷进行HPLC 定量分析，色谱条件为：Agilent 5 TC-C18 色谱柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，检测波长315 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，流速为1 mL·min-1；流动相体系为0.2 %磷酸-甲醇（60∶40），等度洗脱30 min。

按照上述色谱条件，配制系列浓度（0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、 0.3 mg·mL-1、 0.4 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1）的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷对照品溶液，HPLC 检测，线性拟合得到回归方程分别为：

式中: x 为对照品的浓度(mg·mL-1)，Y 为峰面积

1.2.2 样品中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷含量测定

称取夏枯草粉末0.5g，于10 mL 50%乙醇中超声提取10 min。过滤得粗提液。取粗提液2 mL 过0.45 μm 微孔滤膜，HPLC 检测得目标产物峰面积，代入回归方程得到产物浓度。产物得率计算公式为：

式中：Y 为产 物 的 率（mg·g-1）；c 为粗提 液 浓 度（mg·mL-1）；v 粗提液为体积（mL）；m 为夏枯草粉末质量（g）

1.2.3 超声辅助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷

根据迷迭香酸类物质的稳定性，实验选取乙醇作为提取溶剂[16]。精确称取夏枯草粉末0.5 g 于容器中，在不同条件下进行超声辅助提取，计算得率。分别考察乙醇体积分数、液料比、空化时间、缓冲时间、超声功率和提取时间对目标产物得率的影响。

2 结果与讨论

2.1 乙醇体积分数的影响

准确称取夏枯草粉末0.5 g，分别加入10 mL 不同体积分数的乙醇（0、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %和80 %），空化时间1.5 s，缓冲时间2.0 s，超声功率250 W，在此条件下超声提取10 min。取滤液过0.45 μm 微孔滤膜，HPLC 检测，计算得率。

乙醇体积分数对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影响如图1 所示，由图可见，随着乙醇体积分数的增加，目标产物迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率增长显著，但当乙醇体积分数超50%时，产物的得率有下降趋势，综合考虑，选取体积分数50 %的乙醇作为最佳浓度。

图1 乙醇体积分数的影响Fig. 1 Effect of ethanol concentration on yield

2.2 液料比的影响

选用50%的乙醇作为提取溶剂，选用不同的液料比（10、15、20、25 和30 mL·g-1），在250 W 功率下，空化1.5 s，缓冲2.0 s，超声提取10 min。图2显示了不同液料比对产物得率的影响。由图可知，随着液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率呈递增趋势，这是由于溶剂用量的增加，物料与溶剂的接触面积增加，有利于目标产物扩散速度的提高。当液料比在增长到25 mL·g-1时，随着液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率变化不明显，因此考虑不造成溶剂的浪费，我们选择25 mL·g-1作为最佳液料比。

图2 液料比的影响Fig. 2 Effect of liquid-solid ratio on yield

2.3 超声时间的影响

选用50%的乙醇，25 mL·g-1的液料比，在250 W功率下考察不同超声时间（1、3、5、7、9 和11 min）对目标产物得率的影响，结果如图3 所示，7 min 之后随着时间的增加，目标产物得率变化不显著，推测可能是由于超声探头直接与提取溶剂与物料接触，能够更充分地破坏细胞壁使目标产物释放，使其在较短的时间内达到提取完全，因此为避免造成资源的浪费，我们选取提取时间7 min 作为最佳的超声时间。

图3 超声时间的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation time on yield

2.4 超声功率的影响

提取溶剂为50%的乙醇，液料比为25 mL·g-1，在不同的超声功率（150 W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W 和500 W）条件下空化1.5 s，缓冲2.0 s，提取7 min。目标产物得率随功率变化的趋势如图4 所示，功率由150 W 增加到300 W 时，目标产物的得率有增加趋势，300 W 之后随着功率的增加，产物得率变化不显著，推测可能是超声探头直接接触物料，避免了超声波在传输过程中能量的损耗，所以较低的功率就能够充分破坏细胞壁，因此将300 W 作为最佳的超声功率。

2.5 空化时间和缓冲时间的影响

在超声功率300 W，超声时间7 min，液料比25 mL·g-1，提取溶剂选用50%乙醇条件下，分别考察不同空化时间（0.5～3.5 s）、不同缓冲时间（0.5～3.5 s）对目标产物得率的影响。不同空化时间对产物得率的影响如图5 所示，0.5 s 至1.5 s 目标产物得率有增加趋势，1.5 s 之后，随着空化时间的增加，目标产物的得率变化不显著，考虑到能耗的因素，因此我们选择空化时间1.5 s 作为最佳条件。

图4 超声功率的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation power on yield

图5 空化时间的影响Fig. 5 Effect of cavitation time on yield

图6 显示了不同缓冲时间对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影响。如图所示，缓冲时间在0.5～2.0 s时间范围内，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率有增加趋势，2.0 s 之后，随着缓冲时间的增加，目标产物的得率有降低趋势，推测可能是随着缓冲时间增加，同一提取过程中空化时间减少，降低了目标产物向溶剂的扩散，从而导致得率的降低。因此，我们选择2.0 s 作为最佳缓冲时间。

图6 缓冲时间的影响Fig. 6 Effect of buffer time on yield

3 结论

实验选用乙醇作为提取剂，通过单因素实验得到超声细胞破碎辅助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的最佳提取工艺：乙醇体积分数50%，液料比25 mL·g-1，空化时间1.5 s，缓冲时间2.0 s，超声功率300 W，提取时间7 min，在最佳条件下迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率为0.71 mg·g-1。超声细胞破碎辅助提取在常温下就可进行，具有提取效率高、时间短、绿色环保的优点。