金匮肾气丸及六味地黄丸对自然衰老小鼠血浆代谢物的影响

2020-07-09梁华王燕朱明雪郭慧闫起西旺李奇玮李泽光

中国中医药信息杂志 2020年6期

梁华，王燕，朱明雪，郭慧，闫起，西旺，李奇玮，李泽光

梁华，王燕，朱明雪，郭慧，闫起，西旺，李奇玮，李泽光

黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040

比较研究金匮肾气丸及六味地黄丸对自然衰老小鼠血浆代谢物的影响，分析代谢通路富集情况。采用基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术的代谢组学方法，经多元统计分析，将质谱同位素分析与数据库检索相结合鉴定衰老相关生物标志物，通过MetPA数据库构建其代谢通路。随增龄改变，小鼠体内物质代谢出现紊乱，在筛选的16个与增龄密切相关的代谢物中，金匮肾气丸回调15个物质，六味地黄丸回调14个物质，两方可共同显著回调D-赤藓糖-4-磷酸、二十二碳六烯酸、脱氧羟腐胺赖氨酸、鸟氨酸和16B-羟基四氮唑5个物质，从而影响戊糖磷酸途径、不饱和脂肪酸的生物合成、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢途径。金匮肾气丸及六味地黄丸均可通过影响氨基酸、糖类和脂肪酸代谢来调整自然衰老引起的代谢紊乱。

金匮肾气丸；六味地黄丸；代谢组学；衰老；小鼠

肾藏精，主生长发育和生殖，人体生命过程中生、长、壮、老、已不同阶段生理状态取决于肾中精气的盛衰变化。肾气由肾精所化，肾阳为一身阳气之本，肾阴为一身阴气之源，故《景岳全书》曰：“五脏之阳气非此不能发，五脏之阴气非此不能滋。”肾阳充盛，肾阴充足，对人体脏腑生理功能维持至关重要。六味地黄丸是经典补肾滋阴方剂，金匮肾气丸是补肾阳的经典名方。现代研究发现，两方均有调节生长发育、延缓机体衰老作用，其机理大多与改善自由基代谢、增强机体抗氧化防御系统及调节免疫等相关[1-2]。目前，对于两首经典补益方剂作用机制研究多偏重单方对机体某些系统的影响，从中医整体多靶点调节角度及两方作用之异同的比较研究较少。

代谢组学通过测定代谢物组成变化，了解机体代谢网络在不同状态下变化规律，与中医学整体观一致，适于中医方剂复杂体系研究[3]。本课题组基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/ MS）方法，探寻两首补益方剂分别对衰老小鼠体内相关代谢差异物及通路的影响，旨在为补阴补阳方剂延缓衰老作用机理及阴阳关系研究提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级ICR雄性小鼠40只，3月龄，体质量（42±2）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（辽）2010-0001，实验前小鼠于代谢笼内适应环境1周，饲养于室温（22±2）℃、相对湿度（55%±20%）环境，自由摄食饮水，饲料由哈尔滨市南岗区玉英养殖厂提供。本实验经黑龙江中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查批准（2014120101）。

1.2 药物

金匮肾气丸（干地黄 24 g，山药12 g，山萸肉12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，炮附片3 g），六味地黄丸（熟地黄24 g，山萸肉12 g，山药12 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g），上述饮片购自黑龙江中医药大学国医堂，均符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。药物浸泡后分别加8倍量水，文火煮沸，持续30 min，提取液过滤，药渣再加6倍量水煎煮，沸腾后持续30 min，提取液过滤，混合2次滤液，80 ℃、0.09 MPa减压浓缩回收溶剂至100 mL，金匮肾气丸配制成浓度为每毫升含0.81 g原药材药液，六味地黄丸配制成浓度为每毫升含0.75 g原药材药液。

1.3 试剂

生理盐水（哈尔滨三联药业有限公司），屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），色谱甲醇（美国赛默飞世尔公司），色谱乙腈（美国赛默飞世尔公司），甲酸（北京迪马科技欧泰科技发展中心）。

1.4 仪器

电子分析天平AL204（上海梅特勒托利多仪器有限公司），微量移液器（上海新汉计量器具技术研究所），KDC-160HR高速冷冻离心机（中国科大创新股份有限公司中佳分公司），超低温冰箱（德国赛默飞世尔科技公司），Acquity UPLCTMBEHC18色谱柱，液相Waters Acquity UPLC（美国Waters公司），质谱Waters LCT Premier XETOF（美国Waters公司），工作站MassLynxV4.1（美国Waters公司）。

2 实验方法

2.1 分组和给药

随机选取小鼠10只为青年组。其余30只正常单笼饲养至20月龄，随机分为老龄组、金匮肾气丸组和六味地黄丸组，每组10只，每日8:30－9:00灌胃给药，根据种属间等效计量换算小鼠和人的系数为0.002 6，计算得出给药体积为每日13 mL/kg（金匮肾气丸给药量10.53 g/kg，六味地黄丸给药量9.75 g/kg）。青年组给予等体积生理盐水灌胃。连续给药30 d，每7 d测量小鼠质量，根据小鼠体质量变化调整给药剂量。

2.2 样本采集

各组小鼠于给药后第30日禁食不禁水，次日眶静脉取血，并用涂有肝素钠的采血管盛接血液，4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上清液（血浆），标记后置于-80 ℃冰箱冻存。

2.3 样本制备

取200 µL自然解冻小鼠血浆样品，加5倍体积冰冷甲醇，涡旋3 min，将其混合液于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，上清液移至另一离心管后重复该条件再次离心，取上清液200 µL供UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 分析条件

Acquity UPLCTMBEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 µm），流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，流动相A为乙腈（0.1%甲酸），流动相B为超纯水溶液（0.1%甲酸）。

电喷雾离子源；正离子：毛细管电压1300 V，锥孔电压60 V，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气体流速20 L/h，离子源温度110 ℃，脱溶剂气体流速750 L/h，碰撞能60 V；负离子：毛细管电压1500 V，锥孔电压70 V，脱溶剂温度350 ℃，其他条件同正离子。准确质量测定用亮脑啡肽氨酸为校正液，浓度1 μg/L，流速20 L/min，校正频率为15 s。

3 统计学方法

4 结果

4.1 质谱检测

将血浆样品处理后进行正负离子模式全扫描，得青年组（a）、老龄组（b）、金匮肾气丸组（c）和六味地黄丸组（d）小鼠血浆样品质谱轮廓总离子流图（见图1），图中各样品代谢轮廓有明显差异。

图1 各组小鼠血浆样品总离子流图

4.2 OPLS-DA及代谢差异物筛选

对青年组和老龄组进行OPLS-DA，结果分离效果较好（见图2），说明随着增龄改变，小鼠体内整体代谢明显变化。S-plot图中离子越靠近“S”两端，贡献越大（见图3），VIP图中离子越靠近“V”两端，对代谢轮廓轨迹产生变化贡献越大（见图4）。本实验中选取VIP＞1且＜0.05认为有显著贡献，筛选潜在生物标志物，在人类代谢产物数据库中搜库，经数据库筛选及大量文献查询，对各差异物进行生物学分析，找出其中与增龄密切相关的17个物质，详见表1。

注：A.正离子；B.负离子

表1 衰老相关代谢物信息

序号物质名称化学式VIP离子 1D-赤藓糖-4-磷酸C4H9O7P 1.837 54正离子 2十五酰辅酶AC36H64N7O17P3S 1.571 79正离子 3二十二碳六烯酸C22H32O2 1.075 23正离子 4脱氧羟腐胺赖氨酸C10H23N3O2 2.250 67正离子 5二十二碳五烯酸C22H34O2 1.065 39正离子 6磷酸丝氨酸C3H8NO6P 1.017 39正离子 7鸟氨酸C5H12N2O2 1.207 05正离子 83-巯基乳酸C3H6O3S 5.306 19正离子 9N-间甲苯酸甘氨酸C10H11NO3 1.345 69负离子 105-胸苷酸C10H15N2O8P 1.833 99负离子 113a,12b-二羟基-5b-胆酸C24H40O4 1.281 31负离子 12牛磺脱氧胆酸C26H45NO6S 1.079 30负离子 137b-羟基-3-氧代-5b-胆酸C25H38O4 1.079 30负离子 1416B-羟基四氮唑C21H32N2O2 1.746 30负离子 15神经节苷脂GM3C53H96N2O21 2.370 34负离子 16S-(PGA2)-谷胱甘肽C30H47N3O10S 1.109 64负离子 17二十二碳六烯酸C22H32O2 2.663 04负离子

4.3 金匮肾气丸和六味地黄丸对代谢物的调节及通路分析

PLS-DA图显示，金匮肾气丸和六味地黄丸组分别与青年组、老龄组代谢轮廓明显分离，各自聚类，说明组间差异明显（见图5）。金匮肾气丸对其中15个物质有不同程度回调（见表2），六味地黄丸对14个物质有不同程度回调，两者共同显著回调且有统计学意义的物质有D-赤藓糖-4-磷酸、二十二碳六烯酸、脱氧羟腐胺赖氨酸、鸟氨酸和16B-羟基四氮唑（＜0.05）。采用Metabo Analyst4.0在线数据库进行通路分析，经MetPA可视化绘图（见图6），5个代谢产物主要参与精氨酸和脯氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、谷胱甘肽代谢和戊糖磷酸途径4条代谢通路。

表2 各组代谢物峰面积均值统计学结果（±s，n＝10）

注：与老龄组比较，*＜0.05，**＜0.01

图6 主要代谢物MetPA分析通路图

5 讨论

肾精化肾气，肾气推动和调控人体的生长发育，促进和调节全身津液代谢，是机体防御功能的根本。肾阳是肾气中有温煦和推动作用的部分，肾阴与肾阳协调共济，参与脏腑气化功能，是人体阴阳之本[4]。衰老是一种渐进性的动态衰弱，存在阴阳虚损及失衡变化，经典补肾名方金匮肾气丸和六味地黄丸常用于延年益寿、延缓衰老。

本实验基于UPLC-Q-TOF/MS技术，经多元统计分析发现，随着小鼠增龄改变，体内代谢物质出现不同程度变化，在筛选的17个与增龄密切相关的代谢物质中，金匮肾气丸对其中15个物质有不同程度回调，六味地黄丸对14个物质有不同程度回调，两方共同显著回调且有统计学意义的物质有5个，参与的代谢通路有4条。其中戊糖磷酸途径是一种产生还原型辅酶（NADPH）和合成戊糖的过程，赤藓糖-4-磷酸是戊糖磷酸途径中重要的中间产物，对细胞能量代谢、肿瘤细胞迁移有调控作用[5]。参与谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢的鸟氨酸是肝脏尿素循环中精氨酸代谢的中间体，在外周细胞中，鸟氨酸可用于合成谷氨酸和谷氨酰胺。谷氨酰胺大量存在于中枢系统，是多种神经递质氨基酸的前体，与老年退行性疾病密切相关[6]。二十二碳六烯酸富集在不饱和脂肪酸的生物合成途径，它是神经系统细胞生长及维持的主要成分，具有视网膜保护、抗炎、抗癌、抗氧化等多种功能，其抗氧化机制与清除超氧阴离子及羟基自由基，提高NADPH活力，抑制磷酸酶A2活性，降低细胞内活性氧相关[7-8]。与青年组比较，D-赤藓糖-4-磷酸、脱氧羟腐胺赖氨酸、鸟氨酸含量在老龄组中明显降低，而金匮肾气丸组和六味地黄丸组表达水平均明显上升，且趋近于青年组。

六味地黄丸中“三补”配伍“三泻”，是滋补肾阴的代表方。金匮肾气丸在六味地黄丸基础上加辛热之桂附，旨在化阴精以“少火生气”，有“阴中求阳”之妙。本实验通过初步比较研究金匮肾气丸和六味地黄丸共同调节衰老相关代谢标志物及代谢路径，发现两方调节作用虽有不同，但均能显著回调5个标志性代谢物质，影响氨基酸、糖类和脂肪酸代谢，提示经典补阴补阳方剂调节自然衰老的多成分多途径作用特点。然而，衰老是一种时空性的发展进程，针对某一阶段的研究结果很难体现整个衰老过程及药物干预后的机制，故本课题后期将设计不同年龄阶段进行多节点系统研究，结合现代多种系统生物学技术进一步验证，以期更好地探究经典补益方剂延缓衰老作用机理及阴阳关系的生物学基础。

[1] 赵建生,叶振邦,赵涛,等.六味地黄丸延缓衰老的临床研究及其药理实验研究[J].世界科学技术－中医药现代化,2006,8(2)：117-122.

[2] 梁华,朱明雪,孙燕佩,等.六味地黄丸、金匮肾气丸的免疫调节作用研究进展[J].中医药学报,2012,40(2)：97-99.

[3] WANG M, CHEN L, LIU D, et al. Metabolomics highlights pharmacological bioactivity and biochemical mechanism of traditional Chinese medicine[J]. Chemico-Biological Interactions, 2017,273：133-141.

[4] 乔文彪,邢玉瑞.肾的精气阴阳辨析[J].中国中医基础医学杂志, 2003,9(10)：14-15.

[5] WONG E Y, WONG S C, CHAN C M, et al. TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator promotes proliferation and invasiveness of nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Oncol Lett,2015,9(2)：569-574.

[6] ALBRECHT J, SIDORYK-WGRZYNOWICZ M, ZIEIELINSK M, et al. Roles of glutamine in neurotransmission[J]. Neuron Glia Biology,2010, 6(4)：263-276.

[7] BAZINET R P, LAYE S. Polyunsaturated fatty acids and their metabolites in brain function and disease[J]. Nature Reviews Neuroscience,2014,15(12)：771-785.

[8] SHIMAZAWA M, NAKAJIMA Y, MASHIMA Y, et al. Docosahexaenoic acid (DHA) has neuroprotective effects against oxidative stress in retinal ganglion cells[J]. Brain Res,2009,1251(28)：269-275.

Effect ofPills andPills on Metabolic Substances in Plasma of Naturally Aging Mice

LIANG Hua, WANG Yan, ZHU Mingxue, GUO Hui, YAN Qi, XI Wang, LI Qiwei, LI Zeguang

To compare the effect ofPills andPills on metabolic substances in plasma of naturally aging mice; To analyze the enrichment of metabolic pathways.UPLC-Q-TOF/ MS-based metabolomics method was used to identify aging-related biomarkers through multivariate statistical analysis, combining mass spectrometry analysis with database search. Metabolic pathways were constructed through MetPA database.With aging, the metabolism of substances in mice was disordered. Among the 16 metabolites closely related to aging,Pills had different degrees of callback to 15 substances, andPills had different degrees of callback to 14 substances, and both could significantly callback D-Erythrose 4-phosphate, docosahexaenoic acid, deoxyhypusine lysine, ornithine, and 16b-hydroxystanozolol, thereby affecting pentose phosphate pathway, biosynthesis of unsaturated fatty acids, glutathione metabolism, arginine and proline metabolism pathway.BothPills andPills can adjust the metabolic disorder caused by natural aging by affecting the metabolism of amino acids, sugars and fatty acids.

Pills;Pills; metabolomics; aging; mice