两种脱细胞支架原位植入转归动物试验研究

潘腾飞 陶剑 蒋彩云 赵伟 宋兵魁 齐树亭

摘要 脱细胞支架通常被用于辅助组织再生修复，然而脱细胞支架植入后与宿主组织间的相互作用和植入转归机制目前尚不清楚。为此本研究制备了牛心包脱细胞支架（S1）和牛皮脱细胞支架（S2）两种材料，通过体外性能测定和体内动物试验，研究脱细胞支架植入后与宿主组织之间的相互作用和其植入转归过程。试验结果显示，两种支架材料植入1个月后均能够与比格犬自体硬脑膜组织融合生长，但是S2植入3个月被完全降解，而硬脑膜缺损位置未见新生硬脑膜组织生成，说明脱细胞支架与宿主组织之间成功整合并不能保证组织再生修复。脱细胞支架植入后会重启ECM动态变化过程，脱细胞支架恢复ECM动态平衡是其能否发挥组织再生/修复能力的必要条件。

关 键 词 脱细胞支架;ECM动态变化;修复;再生;重建

中图分类号 R332     文献标志码 A

The in situ evolution process of two acellular scaffolds after surgical implantation

PAN Tengfei1，2， TAO Jian 2， JIANG Caiyun2， ZHAO Wei2， SONG Bingkui1， QI Shuting1

（1. School of Chemical Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 300130， China; 2. Tianjin Ouerke Medical Technology Co.， Ltd， Tianjin， 300000， China）

Abstract Acellular scaffold is usually used to assist tissue repair and regeneration. However， many problems remained. For instance， the interactions between acellular scaffolds and host tissues and the mechanism of tissue repairing and regeneration. Therefore， two kinds of acellular scaffolds were prepared， including sample 1 （S1， decellularized bovine pericardium） and sample 2 （S2， decellularized bovine skin）. The in vitro characteristics and in vivo performance in Beagles model were measured. The results showed that both of the two scaffolds were successfully integrated with beagles autologous dura after one month implantation. S1 remained its original shape after 3 months implantation， However， S2 were completely degraded after 3 months implantation. There were no newly regenerated dura tissues. The result indicated that successful integration could not guarantee tissue regeneration. The ECM dynamics would restart after surgical implantation. The ECM dynamics balance in acellular scaffolds should also be established. The restoration of ECM dynamics in acellular scaffold was necessary for tissue repairing/regeneration.

Key words acellular scaffold; ECM dynamics; repairing; regeneration; remodeling

0 引言

哺乳動物的基质受到严重损伤后不能再生[1-3]。为了辅助组织再生修复，临床上经常采用动物源性脱细胞支架材料模拟受损组织的细胞外基质（ECM），辅助组织再生修复[4-5]。动物源性脱细胞支架已经在临床上得到广泛应用[6]，脱细胞猪角膜基质在临床的成功应用表明脱细胞支架在组织修复过程中的重要潜力[7]。

软组织修复过程通常被分解为连续又相互重叠的4个阶段，包括凝血阶段、炎症阶段、增生阶段和重构阶段[8-10]。脱细胞支架作为ECM的模拟物，植入后会被卷入组织修复过程中，经历与机体自身ECM相似的生理过程。ECM一直处于降解-重构动态变化过程中（ECM动态变化），作为细胞的主要微环境，ECM动态过程参与众多细胞行为包括细胞增殖、黏附、迁移、分化和死亡过程[11]，理解ECM动态变化及其规律是组织工程和再生医学的精髓[12]。

作为异种支架材料，脱细胞支架材料免疫原性去除通常被作为研究的重点，而脱细胞支架植入后与周围组织的相互作用过程尚不清楚且常常被忽略。为了研究脱细胞支架与宿主组织之间相互作用规律以及影响脱细胞支架能否发挥组织修复作用的主要因素，我们采用体外及体内动物试验，检测脱细胞支架体外性能，观察脱细胞支架植入转归过程，希望能够找到影响脱细胞支架与宿主组织整合的主要因素，评价ECM动态变化对脱细胞支架辅助组织再生修复过程的影响。

1 材料和方法

1.1 样品制备

本研究制备了两种脱细胞支架，一种为牛心包脱细胞支架（样品1，S1），另一种为牛皮脱细胞支架（样品2，S2）。样品1制备过程大致如下：从屠宰场取材牛心包，带回实验室，用镊子去除牛心包糙面脂肪，用生理盐水冲洗去除牛心包的组织液和血液。然后进行脱细胞处理，牛心包脱细胞处理过程由天津欧尔克医药科技有限公司进行。牛心包脱细胞处理完成后不進行化学交联或化学修饰，然后将脱细胞样品裁切为6 cm×8 cm矩形，生理盐水湿态保存于塑料袋中，最后用25 kGy 钴60γ射线辐照灭菌。

样品2（S2）为脱细胞牛皮，其制备过程大致如下：将新鲜牛皮取回实验室，去除毛发和脂肪组织，用片皮机将牛皮切割成薄层，然后进行脱细胞处理，牛皮脱细胞处理由天津欧尔克医药科技有限公司进行，制备完成后将牛皮用冷冻干燥机冻干，冻干过程防止塌陷。样品装袋后用25 kGy 钴60γ射线灭菌。

1.2 体外理化性能

1.2.1 DNA残留

DNA残留量测定采用PicoGreen 荧光染色法[13-14]。简单来说测定过程主要包括3个步骤，分别为蛋白酶K消化、DNA提取和DNA测定。将S1及其原始组织（3个重复）用纯化水冲洗3次去除氯化钠残留，用冻干机将样品冻干。将各试样剪碎，称取大约10 mg样品，放入DNA free试管，用蛋白酶K消化至样品溶解。用PreSEQTM双链DNA检测试剂盒提取样品和DNA标准品的DNA。提取的样品用荧光燃料染色，用荧光酶标仪检测各个样品的荧光强度。DNA标准品的回收率应超过50%，r2应大于0.95。DNA残留量通过DNA标准品方程和回收率方程测量得出。

1.2.2 热皱缩温度

热皱缩温度可用于反映样品的热稳定性。通常来说，脱细胞支架的热稳定性越高，其胶原蛋白分子内部的交联度越高。热皱缩温度测定方法采用JM Lee的方法[15]，测定方法如下：将样品裁切为3 mm×30 mm（3个重复），然后将样品两端连接到热皱缩测定仪上，向烧杯中加入适量水，用烧杯将样品浸没，升高烧杯内水体的温度，温升速率约2 ℃/min，密切观察指针偏转情况，当支架材料热变性时，样品发生皱缩，带动指针偏转，记录此时水体温度即为该样品的热皱缩温度。

1.2.3 抗胶原酶酶解能力

抗胶原蛋白酶酶解能力采用细菌胶原蛋白酶（Sigma-Aldrich >125 CDU/mg）酶解样品，通过酶解所需时间反应试样的抗酶解能力。测定过程如下，无菌操作将样品裁切为1 cm×1 cm 矩形，将样品（3个重复）放于0.1 mg/mL 胶原蛋白酶溶液（0.01 mol/L Tris-HCL，pH 7.2， 50 mmol/L CaCl2）中浸泡0～200 h。胶原酶溶液使用前须用0.22 μm滤膜过滤除菌。每2 h检查样品外观，当样品完全溶解于溶液中时，记录样品完全溶解所需时间。

1.2.4 体外细胞毒性

体外细胞毒性采用ISO10993.5—2009附录C中MTT方法进行测定[16]。体外细胞毒性可用来反映支架材料的可滤沥物。样品浸提液制备方法参照ISO10993.12—2012制备[17]，具体来说，按照样品表面积/萃取液为3 cm2/mL、（ 37±1） ℃浸泡（24±2） h制备检验液。采用康宁细胞培养瓶碎片颗粒作为阴性对照。采用含有5%二甲基亚砜的RPMI 1640培养基作为阳性对照。复苏L929小鼠成纤维细胞，待细胞处于指数生长期时，用胰蛋白酶酶解，制备得到1×104 个/mL细胞悬液。取细胞悬液加入至96孔板中，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，此时细胞沉底，贴附于孔板底表面，吸弃培养基更换为样品浸提液，继续培养72 h，加入20 μL、5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。吸弃培养基，每孔加入150 μL的DMSO，震荡均匀后于570 nm测定吸光度。细胞增殖率（V，%）按照下式计算：

式中：A570e和A570b为试验品和空白对照品的吸光度。细胞增殖率越低，表明样品的细胞毒性越强。根据标准规定，细胞增殖率高于90%时，认为样品无细胞毒性，细胞毒性为1级。

1.3 体内动物试验研究

两种脱细胞支架材料与硬脑膜组织在结构上相似[18]，且都是由Ⅰ型胶原蛋白组成[19]，因此本研究通过比格犬硬脑膜修复试验，研究两种脱细胞支架对硬脑膜组织缺损的修复过程。

动物原位植入试验设置1个月、2个月和3个月3个植入期，每个时间点植入4只试验动物。植入期结束后处死试验动物，通过大体解剖和病理制片评价试样与比格犬硬脑膜组织之间的相互作用，评价脱细胞支架的整合、降解、再生以及试样与周围组织的病理反应情况。

动物原位植入试验植入过程如下：采用盐酸氯胺酮（50 mg/kg）和速眠新Ⅱ（50 mg/kg）肌肉注射全麻试验动物，麻醉后将比格犬呈俯卧位绑于手术台上，头皮备皮后用碘伏充分消毒，铺无菌巾。沿头顶正中纵向切开头皮和头部肌肉组织，双极电灼止血，用骨膜分离器分离肌肉组织，暴露颅骨。用电动高速磨钻于颅骨中线旁约1 cm处分别磨开2个大小约4 cm × 3 cm的骨窗，骨蜡止血。取下骨组织，暴露比格犬自体硬脑膜（图1a）），用眼科剪制造硬脑膜缺损（图1b）），双极电凝彻底止血，避免脑积水等并发症发生。

将样品裁剪为对应形状，光面朝内贴附于大脑硬脑膜缺损处（图1c）），样品与比格犬硬脑膜缺损边缘重叠约0.3 cm。手术结束后将动物放回饲养室，肌肉注射庆大霉素（4 000 U/kg）预防手术创口感染。饲养员定期观察动物术后有无正常进食、饮水及有无中枢神经损伤引起的运动障碍等。

饲养期到期后，对试验动物执行安乐死。解剖观察手术创口愈合，试样降解吸收，并发症以及黏连情况等。将解剖取下的硬脑膜替代物及周围组织用福尔马林固定，病理制片，通过组织病理制片评价脱细胞支架与比格犬自体硬脑膜整合情况，观察比格犬自体硬脑膜是否有降解或再生，评价脱细胞支架与其周围组织的植入病理状况。

2 结果

2.1 DNA残留量

由于核酸（DNA）具有黏性，最难从组织中去除[20]，因此采用DNA残留量来定量反映动物组织的脱细胞处理效率。

动物组织及其脱细胞后DNA残留量结果如图2所示。牛心包组织（脱细胞处理前）的DNA残留量为（845.0±144.6） ng/mg干重，牛心包脱细胞支架（S1）的DNA残留量为（4.31±0.13） ng/mg。牛皮组织（脱细胞处理前）的DNA残留量为（687.8±82.0） ng/mg干重，其脱细胞支架（S2）的DNA残留量为（44.04±1.07） ng/mg。据报道DNA残留量小于50 ng/mg时，机体对脱细胞支架不会产生明显细胞或组织排异反应[21]。两种脱细胞支架的DNA残留量均在可接受范围内，所以两种脱细胞支架的抗原成分均已经得到有效去除，理论上来说，植入后不会产生明显免疫排斥反应。

2.2 热皱缩温度和抗酶解性能

胶原蛋白的特征性三螺旋结构对于其生物活性具有重要影响，S1（牛心包）和S2（牛皮）的热皱缩温度分别为（60±1.2） ℃和（61±0.9） ℃，两种材料的热皱缩温度均较高，说明2种脱细胞支架的胶原蛋白均没有发生变性，两种脱细胞支架材料均保留着基于胶原蛋白三螺旋结构的生物活性。

本试验采用细菌胶原蛋白酶浸泡两种脱细胞支架，通过测量试样从浸泡开始至其完全被酶解的时间，定量表征试样的抗酶解能力。本试验结果显示，S1样品的抗酶解时间为56 h，S2的抗酶解时间是24 h，2种样品的细菌胶原蛋白酶酶解试验显示，在体外降解试验中，S2比S1更易于被酶解，根据体外酶解试验，推测S2原位植入后比S1更加易于被酶解。

热皱缩温度结果表明两种脱细胞支架具有相似的热稳定性，然而它们的抗酶解能力差异较大，样品2更易于被酶解。

2.3 体外细胞毒性

体外细胞毒性结果显示S1（牛心包）和S2（牛皮）的细胞增殖率分别为（93.4±2.5）% 和 （90.2±3.1）%（3个重复）。阴性对照和阳性对照的细胞增殖率分别为（95.1±4.1）% 和 （10.9±1.6）%（图3）。阳性对照和阴性对照结果显示细胞毒性测试试验结果成立，两种脱细胞支架的细胞增殖率都高于90%，细胞毒性分级均为1级，说明两种脱细胞支架基本无有毒有害可沥滤物析出，脱细胞支架在组织生化处理过程中无有毒有害化学物质残留。

2.4 扫描电镜结果

两种样品的扫描电镜结果如图4所示，从图4a）与图4b）、图4c）与图4d）的对比可明显看出，S1（牛心包）的孔径较S2（牛皮）致密，S1的平均孔径大小约为2 μm，低于大多数哺乳动物细胞直径，此外S1的两面在孔径和外观方面有较大差异，光滑面相比粗糙面胶原纤维结构更加规则和致密。与S1试验结果相反，S2的孔径大约有15 μm，略高于细胞平均直径，因此大部分细胞可自由迁移进入S2脱细胞支架内部。

2.5 体内动物实验结果

試验动物均存活至指定时间节点，所有动物无术中和术后死亡。动物手术后2 ～ 5 d后恢复常规饮食，未见有炎症、出血、脑脊液渗漏、水肿、癫痫等不良反应。

2.5.1 大体解剖

植入1个月大体解剖结果显示，S1（牛心包）和S2（牛皮）均与宿主硬脑膜组织整合生长（图5 a）， b））。两种样品与比格犬自体硬脑膜整合位置连续、紧密，无渗漏。植入物周围无组织炎症或坏死，两种支架与脑组织间有轻微黏连，可用镊子轻易分离。

植入2个月，两种脱细胞支架的大体解剖结果与植入1个月结果相似，两种样品均与比格犬硬脑膜整合生长，S1（牛心包）植入2个月外观呈乳白色，未见降解，此外S1内部无明显血管化（图5 c））。从整合效果上来看，S1与比格犬自体硬脑膜融合生长位置光滑，连接紧密，镊子难以撕裂，说明S1与比格犬自体硬脑膜融合生长部位已经被较好重构，相反S2虽然也显示与比格犬自体硬脑膜融合生长，但是其机械性能大幅度降低，在解剖过程中，即使非常谨慎，仍然造成样品撕裂（图5 d））。

植入3个月，S1（牛心包）大体外观无明显改变，样品无明显降解，样品与比格犬自体硬脑膜融合生长位置连接紧密强度高，难以用镊子撕裂（图5 e））。相比S1完整的外形结构和较高的机械强度，S2（牛皮）植入3个月已经完全不可见，材料已经被完全降解。S2降解后留下一个空洞，植入位置未见新生硬脑膜组织，可见植入时取下又放回的颅骨瓣（图5 f）），颅骨瓣与硬脑膜组织之间形成纤维瘢痕组织，难以与比格犬自体硬脑膜分离。

2.5.2 组织病理结果

与大体解剖结果相对应，植入1个月病理结果显示，两种样品均与比格犬自体硬脑膜融合生长，两种样品均保持原结构，周围均无纤维包裹，无明显降解，试样与周围组织无明显炎症反应和免疫反应（图6 a），b））。S1（牛心包）较比格犬自体硬脑膜厚度更厚，S1表层可见细胞浸润，内部无细胞浸润，也无血管化。S2全层可见细胞浸润（图6b）），整合区域可见类似肉芽组织结构。

植入2个月病理结果显示，S1与周围硬脑膜组织及大脑组织间无炎症反应，成纤维细胞浸润S1样品厚度的一半，基本无毛细血管（图6c））。植入2个月，S2全层可见宿主细胞浸润，样品组织病理显示原始结构被改变，显示材料被部分降解（图6d））。S2（牛皮）植入2个月结果可见局部钙化，样品1中未见。

植入3个月，S2的H&E病理染色图（图6f））结果中未见其特征性的纤维结构，病理结果与大体解剖结果一致，说明补片已经被降解。S1的全层已经被成纤维细胞浸润，补片保持原来形状，S1未见明显降解（图6e）），结合大体解剖结果，补片整合生长部位已经被重构为光滑的结缔组织，组织周围也无炎症反应，说明S1已经进入稳定状态。

3 讨论

3.1 体外性能与体内植入性能之间的联系

脱细胞支架的体外性能对其体内生物学相容性、组织再生修复活性有重要影响，通过本试验中S1和S2的体外性能能够推测的重要的体内性能如表1所示。

胶原蛋白的生理活性是基于其特征性三螺旋结构实现的，热皱缩温度能够反映胶原蛋白是否已经发生变性。本试验中，两种支架材料的热皱缩温度高于胶原蛋白分子的变性温度，说明两种脱细胞支架均保留了胶原蛋白三螺旋结构，两种材料保留了胶原蛋白的生物活性。

抗酶解性能与脱细胞支架材料的交联度有密切的关系。在生物体内，原胶原分子之间的交联通过赖氨酸氧化酶实现共价交联[22]。在体外，可以利用化学交联剂如戊二醛、碳化二亚胺（EDC）等实现胶原蛋白分子内交联，脱细胞支架的稳定性是由其胶原蛋白分子内部交联度决定的[23]。一般来讲，交联度越高其热稳定性越高，抗酶解性能也越强，另外胶原蛋白交联度随年龄增长而增高。细胞外支架的交联度越高其抗酶解性能越强，脱细胞支架的降解速度越慢。

孔径是另一重要的体外性能指标，当脱细胞支架的孔径大于细胞平均直径时，细胞能够自由迁移进入脱细胞支架内部。然而脱细胞支架不具有区分进入其内部细胞类型的能力。脱细胞支架植入后，周围宿主组织进入组织修复过程，组织修复过程包括出血、炎症、增生和重构4个阶段，每个阶段参与的细胞种类、数量和其生理功能各不相同，例如出血阶段以血小板和红细胞为主，炎症阶段以中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞为主，增生阶段和重构阶段以成纤维细胞为主[24]。在组织修复过程中，炎症阶段的中性粒白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞具有分泌基质金属蛋白酶的能力，能够酶解脱细胞支架，对其辅助组织再生修复具有较大影响，如果脱细胞支架孔径远大于宿主组织中炎症细胞的直径，炎症细胞可自由进入脱细胞支架内部，容易导致脱细胞支架被过早酶解，造成其组织再生修复过程的失败。

根据目前的研究进展，脱细胞支架的一些体外性能对其体内生物学活性有决定性影响，例如脱细胞支架中，保持胶原蛋白的特征性三螺旋结构是促凝血性能的重要保证;保留胶原蛋白的自由氨基是保证其与宿主组织整合的必要条件[25];脱细胞支架中残留外源DNA含量的高低通常代表了组织脱细胞效率和材料的免疫原性，过量DNA残留会使材料植入后影响宿主周围组织的修复过程，延长炎症反应阶段的时间;体外细胞毒性通常代表材料毒性化学物质的残留，这会影响脱细胞支架的生物学相容性，因此脱细胞支架的体外性能对体内生物活性、生物学性能、组织再生修复活性等有重要影响。因此在制备脱细胞支架时，应首先对制备的脱细胞支架的这些重要的体外性能进行表征，脱细胞支架的体外性能测试是其体内原位辅助组织再生修复功能的重要前提。

综上所述，根据体外性能测试结果，两种脱细胞支架材料的胶原蛋白均未变性;DNA残留量结果显示两种材料抗原成分有效去除;体外细胞毒性通过测定浸提液的方法进行，测定结果表明两种脱细胞支架材料中无有毒有害化学可滤沥物释放。体外测试结果表明两种材料能够满足体内原位植入基本要求。

3.2 脱细胞支架整合与辅助组织再生的关系

根据组织修复过程的特点，软组织修复过程分为4个连续而又重叠的阶段。脱细胞支架通过外科方式植入后，势必引起宿主组织损伤，并开启组织修复过程。脱细胞支架将会被迫融入宿主组织修复过程中。

脱细胞支架取材于动物源性组织，其生理活性与供体动物组织的生理状态相一致。通常脱细胞支架取材于动物源性正常成熟组织。脱细胞支架植入后会融入宿主组织ECM动态变化过程中，被宿主组织的生理状态影响和改变。在凝血阶段，由于手术植入损伤，组织触发凝血过程。凝血过程形成的血栓一方面有利于止血，防止血液过量流失，另一方面凝血作用形成的血栓能够通过物理吸附和共价交联的方式连接脱细胞支架与宿主组织，脱细胞支架与宿主之间建立的稳定连接有助于后续多种生理活动例如血管形成和整合。

本试验中，植入1个月的大体解剖和病理染色结果显示，两种样品均能够与宿主组织整合生长。脱细胞支架与比格犬自体硬脑膜的整合说明脱细胞支架已经融入比格犬自体硬脑膜ECM动态变化过程中，脱细胞支架与比格犬自体硬脑膜之间已经通过赖氨酸氧化酶催化形成共价交联。ECM动态变化过程包括ECM成分的合成和降解两部分，ECM支架合成需要成纤维细胞迁移进入脱细胞支架内部，启动胶原蛋白合成和分泌。

脱细胞支架孔径的大小对于其原位重构有重要影响。在炎症反应阶段，当脱细胞支架的孔径大于细胞平均直径时，炎症细胞例如中性粒细胞、巨噬细胞等能够自由进入脱细胞支架内部，分泌胶原蛋白酶，加速脱细胞支架的降解过程。ECM的体内降解是在基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase， MMP）介导下进行的。在炎症反应阶段，组织内部变化剧烈，凝血阶段形成的血栓会逐步转化为肉芽组织，相应地其ECM支架将由血栓的纤维蛋白转化为以I型和III型胶原蛋白为主的肉芽组织。ECM的剧烈变化需要高浓度的MMP[26，27]。刚植入的脱细胞支架需要承受炎症反应过程中过量基质金属蛋白酶的影响，脱细胞支架中残留抗原成分、支架胶原损伤、支架内胶原蛋白组成差异以及手术损伤等均会促使宿主组织细胞启动MMP的合成和分泌。在众多种类的MMP当中，MMP-1、MMP-8和MMP-13能够对脱细胞支架起到直接的酶解作用[28-30]。脱细胞支架应具有一定抗酶解性能，例如胶原蛋白海绵皮肤替代物的半降解周期为（2±1）周[31]，否则胶原蛋白海绵不具有辅助皮肤组织再生修复的功能。本试验中S1孔径较小，S1全层被细胞浸润需要3个月时间，S2由于孔径大于一般细胞直径，因此其植入1个月即可见全层细胞浸润。孔径较大的脱细胞支架虽然有利于细胞的遷移进入，但是脱细胞支架不具有区分进入其内部细胞的种类的能力，在炎症阶段，大量炎症细胞的进入容易导致脱细胞支架被过早酶解，可能导致脱细胞支架被过早酶解失效。

植入1個月时，两种样品均能与比格犬硬脑膜组织融合生长，并且脱细胞支架与比格犬自体硬脑膜组织之间无明显炎症反应，说明两种脱细胞支架周围组织进入组织增生阶段。在组织增生阶段，组织内部MMP分泌量降低，能够合成ECM组分的成纤维细胞数量增多，因此在增生阶段，脱细胞支架受到的酶解作用降低，脱细胞支架不易被酶解，然而S2的原位植入试验结果显示，即使在样品植入2个月，比格犬硬脑膜组织已经进入了组织增生和重构阶段后，S2最终仍然在第3个月被完全降解，说明成功整合并不能保证其组织修复重建性能，脱细胞支架内部还应建立ECM动态平衡，防止其被过度降解而失效。

3.3 脱细胞支架恢复ECM动态平衡的意义

脱细胞支架植入后，随着宿主细胞迁移进入脱细胞支架内部，脱细胞支架重启ECM动态过程，此时ECM动态过程尚不平衡。ECM动态平衡是由细胞精确调控，包括MMP在基因水平以及MMP和TIMP水平的调控。一般来讲，系统都有自身调控能力，例如生态系统具有其自身的调节控制能力，但是如果系统内或系统外影响过大时，整个系统将失去平衡，例如水体生态系统具有污染物自净功能，但是如果影响超过了系统的自身调节能力，系统将失去自我调节能力。ECM动态平衡系统也遵循相同的规律，当影响ECM动态平衡的因素超过其自身修复能力，例如脱细胞支架残留细胞，导致过度免疫原性，脱细胞支架内部无法形成ECM动态平衡，最终会造成脱细胞支架的彻底降解。

脱细胞植入后，如果被宿主细胞认为“新ECM成分”，脱细胞支架将会在赖氨酸氧化酶等的介导下，被共价交联于其自身ECM上，完成脱细胞支架的整合。脱细胞支架与宿主组织的顺利整合能够保证后续血管化以及组织重构过程的顺利进行，所以整合是后续重构过程的前提。

脱细胞支架与宿主组织的成功整合，为宿主细胞迁移进入脱细胞支架内部，从而重启脱细胞支架的ECM动态平衡提供条件。然而脱细胞支架的ECM动态变化过程会受到炎症反应阶段的强烈干扰，炎症细胞会分泌基质金属蛋白酶，对脱细胞支架起到强烈的酶解作用，容易导致脱细胞支架辅助组织再生修复功能的失效。

脱细胞支架经过了宿主组织的炎症反应阶段，到达组织增生和重构阶段后，也不能保证脱细胞支架ECM动态恢复平衡，例如本试验中，S2（牛皮）虽然能够与宿主整合并通过炎症反应阶段，但是其在植入3个月后仍然被完全降解，而比格犬硬脑膜缺损位置也没有新生硬脑膜组织，说明S2中始终未能建立起ECM动态平衡，最终导致脱细胞支架辅助组织再生修复过程的失败。S1能够与比格犬自体硬脑膜组织成功整合，且其整合位置光滑，脱细胞支架与比格犬自体硬脑膜之间机械强度较高，整合位置可见成纤维细胞浸润，无炎症细胞，说明补片被部分重构，并进入了稳定状态。

即使脱细胞支架能够与周围组织建立起ECM动态平衡也不能保证组织再生修复，例如在正常皮肤组织的损伤修复过程中，如果皮肤损伤较严重，创伤肉芽组织虽然保证ECM动态平衡，但是其结局通常为疤痕组织形成，无法形成功能性组织。脱细胞支架与宿主组织整合生长之后，脱细胞支架的结局可能为：部分重构、组织再生或疤痕组织形成（图7）。脱细胞支架植入后，应该首先保证脱细胞支架能够形成ECM动态平衡，这是保证其能否发挥组织再生修复功能的必要条件。

4 结论

脱细胞支架植入后随着宿主细胞迁移进入其内部，逐渐恢复自身ECM动态变化过程。脱细胞支架的ECM动态平衡恢复过程中，炎症反应阶段的炎症细胞和高MMP表达水平容易导致脱细胞支架的酶解失效。

本试验结果显示，脱细胞支架（S2）虽然能够与比格犬自体硬脑膜组织整合生长，但是其最终仍然被机体降解，因此脱细胞支架与宿主组织成功整合生长不能保证脱细胞支架具有辅助组织再生修复的能力。脱细胞支架辅助组织再生修复功能发挥还需要在其内部建立ECM动态平衡，脱细胞支架内部能否恢复ECM动态平衡是其能否发挥组织再生/修复能力的必要条件。

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[責任编辑    付    婷    田    丰]