用HPLC波长切换法同时测定甲氯霜中3种成分的含量

郝 哲，邱会苹，张素娜，樊晓雷，王伟勤，屈 俊

(联勤保障部队第九八八医院药剂科，郑州 450042)

甲氯霜系联勤保障部队第九八八医院自制制剂，主要用于干性皮脂溢出症、痤疮、疱疮等症，疗效颇佳。该制剂处方以甲硝唑、氯霉素为主药，以羟苯乙酯为抑菌剂。甲硝唑为硝基咪唑衍生物，对大多数厌氧菌具有强大的抗菌作用[1]，但药品不良反应(ADRs)限制了其应用。甲硝唑现多采用外用剂型，具有用量小、局部浓度高、作用持久、ADRs少、无全身给药弊端等特点，且对皮肤无刺激性[2]。氯霉素局部外用可减少或抑制痤疮棒状杆菌，减轻炎症反应[3]。羟苯乙酯为尼泊金酯类防腐剂，具有广谱抑菌作用，常用于食品、药品和化妆品中[4]。人用药物注册技术要求国际协调会议(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)明确提出应建立抑菌剂含量测定方法[5]。若药物制剂中抑菌剂用量不足，便达不到有效抑菌浓度，而用量过大，则具有一定毒性，易引起ADRs[6]。近年来，人们越来越重视制剂中羟苯乙酯的含量控制。虽已有文献[7-8]报道其他制剂中甲硝唑、氯霉素的含量测定方法，但均为单波长法。本研究首次采用HPLC波长切换法同时测定甲氯霜中甲硝唑、氯霉素及羟苯乙酯3种成分的含量，该方法简便、快速，可为甲氯霜制剂质量标准的制定提供一定的科学依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器 岛津LC-10A高效液相色谱仪(包括SPD-10A 紫外检测器和LC-solution Lite色谱工作站，日本岛津公司)；BT-125D型电子天平(精度0.01 mg/0.1 mg，称量范围41 g/120 g，德国赛多利斯有限公司)；AS3120A 型超声波清洗器(天津Auto-science公司)；Wondasil C18色谱柱(日本岛津公司)。

1.2 药品和试剂 甲硝唑对照品(纯度99.9%，批号100191-201507)、氯霉素对照品(纯度99.8%，批号130555-201704)、羟苯乙酯对照品(纯度99.9%，批号100847-201604，中国食品药品检定研究院)。甲氯霜(规格30 g/支，批号180911、180912、180913)和阴性样品均为本院自制；水为自制蒸馏水；甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)和0.5%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脱：0～8 min 35%A，8～16 min 35%～45%A，16～30 min 45%～60%A；柱温为40 ℃。检测波长：0～8 min在320 nm处检测甲硝唑，8～16 min在278 nm处检测氯霉素，16～30 min在254 nm处检测羟苯乙酯。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取甲硝唑对照品9.68 mg和氯霉素对照品9.58 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液1。精密称取羟苯乙酯对照品11.72 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液2；再精密量取1 ml对照品储备液2置25 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液3。分别精密量取对照品储备液1和对照品储备液3各3 ml置10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 另取甲氯霜约0.5 g，精密称定，置烧杯中，加乙醇约30 ml，置80 ℃水浴中加热2 min，振摇使溶解，转移至50 ml量瓶中，放冷至室温，用乙醇稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却3 h，取出后迅速滤过，续滤液放至室温，再精密量取3 ml置10 ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 根据处方中药物的比例，按相关工艺制备不含甲硝唑、氯霉素和羟苯乙酯的阴性样品，再按2.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性实验 分别取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl注入HPLC仪，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。由图1可见，各主成分分离度好，阴性样品在3种成分相应位置上无吸收，表明阴性无干扰。

图1 甲氯霜的HPLC谱图Figure 1 HPLC chromatograms of Jialv creamA:混合对照品溶液;B:供试品溶液;C:阴性样品溶液；1：甲硝唑;2：氯霉素;3：羟苯乙酯

2.4 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下对照品储备液1和对照品储备液3各2、2.5、3、3.5、4 ml置10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，分别吸取10 μl注入色谱仪，按2.1项下色谱条件测定。以对照品的质量浓度(c，单位μg/ml)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得到甲硝唑、氯霉素及羟苯乙酯的回归方程分别为A甲硝唑=3.01×104c+3.28×103(r=0.999 9)，线性范围38.68～77.36 μg/ml；A氯霉素=1.91 ×104c-6.19×103(r=0.999 9)，线性范围38.24～76.49 μg/ml；A羟苯乙酯=7.86×104c+4.78×102(r=0.999 9)，线性范围1.87～3.75 μg/ml。结果表明，3种成分在相应范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 吸取2.2.1项下混合对照品溶液，重复进样6次，每次10 μl，测定其峰面积并计算RSD值。结果甲硝唑、氯霉素及羟苯乙酯峰面积的RSD值分别为0.73%、0.97%、1.02%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 精密称取6份样品(批号180911)各0.5 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，结果甲硝唑、氯霉素及羟苯乙酯峰面积的RSD值分别为1.01%、0.93%和1.11%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性实验 取2.6项下1号供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12 h进样10 μl，测定峰面积并计算RSD值。结果甲硝唑、氯霉素及羟苯乙酯峰面积的RSD值分别为1.03%、0.98%、1.11%(n=5)，表明供试品溶液在配制后12 h内稳定。

2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品9份(批号180911)，每份约0.25 g，按照样品中各成分含量的80%、100%、120%分别精密加入相应对照品(甲硝唑对照品溶液浓度为1.065 mg/ml，氯霉素对照品溶液浓度为1.004 mg/ml，羟苯乙酯对照品溶液浓度为0.234 2 mg/ml )，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定，计算平均回收率。结果甲硝唑、氯霉素和羟苯乙酯的平均回收率分别为(99.4±0.4)%、(99.3±0.8)%、(98.9±0.4)%(n=9)。

2.9 样品含量测定 分别取3批样品，每批3份，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行含量测定，以外标法计算含量，结果见表1。

表1 甲氯霜中甲硝唑、氯霉素和羟苯乙酯含量测定结果
Table 1 Determination results of the components of
metronidazole,chloramphenicol and
ethylparaben in Jialv cream

批号甲硝唑氯霉素羟苯乙酯18091119.44±0.1018.07±0.050.92±0.0118091219.41±0.2118.30±0.150.97±0.0118091319.18±0.1517.71±0.190.97±0.01

2.10 含量限度确定 本处方中甲硝唑和氯霉素的理论含量均为18.8 mg/g，羟苯乙酯理论含量为1 mg/g，取其标示量的90.0%～110.0%为含量限度，即得甲硝唑和氯霉素的含量限度均为16.9～20.6 mg/g，羟苯乙酯的含量限度为0.9～1.1 mg/g。本研究所测含量结果均在此范围内。

3 讨 论

3.1 提取溶剂的选择 作者曾比较了甲醇、乙醇两种提取溶剂，结果两者提取的样品冰浴后，基质均无明显析出，但乙醇提取的样品中3种药品含量均略高且杂质峰面积较小，故选择乙醇为提取溶剂。另在提取过程中，瓶底部有少许黄色团状物，其为升华硫，在滤过中除去，不影响含量测定。

3.2 冰浴时间的考察 预实验中曾考察了冰浴1、2、3、4 h对提取效果的影响。结果冰浴3 h与4 h药品含量基本一致，表明冰浴3 h即可将有效成分提取完全，故选择冰浴3 h。

3.3 流动相的选择 本研究曾考察甲醇-乙腈-水(50∶5∶45)[7]体系作为流动相，但羟苯乙酯峰保留时间为33 min，出峰时间较迟；又考察了甲醇-水(68∶32)[8]体系，氯霉素峰拖尾严重；后尝试甲醇-0.1%冰乙酸溶液与甲醇-0.5%冰乙酸溶液体系，结果发现甲醇-0.5%冰乙酸溶液体系比甲醇-0.1%冰乙酸溶液体系分离效果好，三者峰形尖锐，拖尾因子符合要求，且均达到基线分离，在25 min内即可完成含量测定，故选择甲醇-0.5%冰乙酸溶液体系作为流动相。

3.4 检测波长的选择 将甲硝唑、氯霉素和羟苯乙酯3种对照品储备液用流动相稀释后在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果甲硝唑、氯霉素、羟苯乙酯的最大吸收波长分别为320、278、256 nm，三者吸收波长差异较大，因此选择波长切换法分别在各自吸收峰值处测定其含量。

3.5 柱温的选择 本研究曾比较了柱温为25 ℃、30 ℃和40 ℃条件下的样品分离情况，发现柱温为25 ℃和30 ℃时，样品分离效果不好，重现性较差，而柱温为40 ℃时，样品各成分峰形对称，均达到基线分离，且重复性好，故选择柱温为40 ℃。