荔枝泛素结合酶基因（LcUBC12）的生物信息学及表达特性分析

董晨 魏永赞 王弋 郑雪文 李伟才 石胜友

摘要：【目的】分析荔枝泛素结合酶（E2）基因（LcUBC12）的生物学信息，并检测其组织表达特异性及烯效唑处理下花穗不同发育阶段中的表达情况，为研究E2响应烯效唑的作用机制及泛素化修饰在调控荔枝花穗发育中的功能提供理论依据。【方法】以从妃子笑荔枝花穗转录组（RNA-seq）数据中筛选出的LcUBC12基因为参考序列，利用本地BLAST从荔枝基因组中查找出该基因cDNA全长（Litchi_GLEAN_10004716），并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测LcUBC12基因在妃子笑荔枝不同组织及烯效唑处理下花穗不同发育阶段的表达情况。【结果】LcUBC12基因cDNA全长519 bp，编码172个氨基酸，其编码的蛋白分子量19.68 kD，等电点6.52，不稳定指数35.70，亲水性的平均值  -0.734，为亲水稳定蛋白，定位于细胞核，不存在信号肽和跨膜结构，包含典型的UBC12保守结构域，属于Class I家族E2蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。LcUBC12蛋白与向日葵（XP_022009656.1）、柑橘（XP_006466720.1）、草莓（XP_004300599.1）和萝卜（XP_018466680.1）等UBC12蛋白的氨基酸序列同源性較高，分别为70.11%、68.16%、67.76%和67.03%。LcUBC12蛋白与芸香科的柑橘UBC12亲缘关系最近，其次是与同属菊科的向日葵和莴苣UBC12蛋白亲缘关系较近。LcUBC12基因在不同组织中表达量排序为雌花>雄花>种子>果皮>叶>茎>根>果肉。烯效唑处理0～21 d LcUBC12基因在花穗中的表达量与对照无明显差异，烯效唑处理28 d其表达量明显低于对照，但烯效唑处理35 d其表达量上调，且较对照高。【结论】LcUBC12基因具有组织表达特异性，在妃子笑荔枝雌花、雄花和种子中高效表达，推测其主要在花穗发育和生殖生长过程中发挥重要调控作用，但烯效唑处理后LcUBC12基因对花穗发育发挥负调控作用。

关键词： 荔枝;妃子笑;泛素结合酶;基因;实时荧光定量PCR;生物信息学;花穗发育;组织表达

中图分类号： S667.103.6                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）05-1091-07

Abstract：【Objective】Biological information of ubiquitin-conjugating enzyme（E2） gene（LcUBC12） in litchi was ana-lyzed， and the expression pattern specificity and the expression of LcUBC12 were studied in different stages of litchi inflorescences under uniconazole treatment. The results could provided a theoretical basis for studying the mechanism of E2 response to uniconazole and the function of ubiquitination modification in regulating the development of Feizixiao litchi inflorescences. 【Method】With LcUBC12 gene screened from the transcriptome data of the Feizixiao litchi inflorescences（RNA-seq） as reference sequence， the full-length cDNA of LcUBC12 was obtained by local BLAST to find the litchi genome（Litchi_GLEAN_10004716）. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） was used to analyze the expression of Feizixiao litchi LcUBC12 in different tissues and at different developmental stages of inflorescence which were treated by uniconazole. 【Result】The cDNA of LcUBC12 gene was 519 bp in length，encoding 172 amino acids with a molecular weight of 19.68 kD and an isoelectric point of 6.52， and the instability index was 35.70， the average hydrophilic value was -0.734， which was a hydrophilic stable protein. The predicted subcellular localization was in the nucleus. There was no signal peptide and transmembrane. The structure contained a typical conserved UBC domain. It belonged to Class  I family E2 protein， the secondary structure of the protein was mainly random coiling. NCBI blast analysis indicated the homology of UBC12 protein amino acid sequence of LcUBC12 amino acid sequence with sunflower（XP_022009656.1），citrus（XP_006466720.1）， strawberry（XP_004300599.1） and radish（XP_018466680.1） were high， which were 70.11%，68.16%，67.76% and 67.03%，respectively.  Phylogenetic analysis indicated that LcUBC12 protein was the closest to citrus UBC12 of Rutaceae and also had close relationship with sunflowers and lettuce of the Compositae. qRT-PCR analysis indicated the expression of LcUBC12 gene in different tissues was female flower>male flower>seed>peel>leaf>stem>root>pulp. The expression treated by uniconazole at 28 d was lower than that in control， however the expression at 35 d up-regu-lated in treatment and was higher than that in control. 【Conclusion】The LcUBC12 gene has tissue expression specificity and is abundantly expressed in Feizixiao litchi female flowers， male flowers and seeds. It is speculated that it mainly plays an important role in the inflorescences development and reproductive growth of litchi， but LcUBC12 gene plays a negative regulatory role in inflorescences development after uniconazole treatment.

Key words： litchi; Feizixiao; ubiquitin-conjugating enzyme; gene; real-time fluorescence quantitative PCR; bioinformatics; inflorescences development; tissue expression

Foundation item： Basic Scientific Research Project of Central Public Welfare Research Institutes（1630062016006）;National Litchi and Longan Industrial Technology System Project（CARS-33-21）

0 引言

【研究意义】泛素化蛋白酶體途径是一种真核生物蛋白质翻译后的修饰途径。在该途径中，泛素主要通过泛素蛋白酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所识别并降解（Ciechanover et al.，2000;Pickart，2001）。在泛素化过程中，泛素与靶蛋白的结合需要3种酶参与，分别为泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素蛋白连接酶（Ubiquitin ligase，E3）。泛素化过程涉及三步酶促级联反应：首先E1激活泛素分子，然后被激活的泛素分子连接到E2上，E3结合目标蛋白并促进E2将激活的泛素分子转移到目标蛋白上，最终实现目标蛋白的泛素化（Kerscher et al.，2006）。可见，E2作为植物蛋白泛素化降解途径中的关键酶，包含典型的UBC保守结构域，长约140～200个氨基酸，在植物生长发育过程中发挥重要作用（Cui et al.，2012）。因此，本研究通过克隆荔枝发育花和果实中的E2基因，研究其编码蛋白生物学信息及表达特性，对其在荔枝坐果中的生物学功能研究具有重要意义。【前人研究进展】目前，E2基因的研究主要集中在对DNA的修复进程和抗逆响应（王金利等，2010），在调控花和果实发育方面研究较少（Wang et al.，2014）。Picton等（1993）首次从番茄中克隆到E2基因，研究发现其在番茄叶片衰老和果实成熟过程中表达。王园等（2010）从香蕉采后早期抑制差减文库中筛选得到E2基因（MaUCE1），研究发现MaUCE1基因可调控香蕉果实成熟过程中淀粉酶活性或含量，在香蕉果实成熟的分解代谢中发挥作用。Li等（2013）通过研究荔枝早期果实发育遮阴处理差异基因表达发现，遮荫处理下UBCE2基因表达量上调，高于对照的表达量，推测遮阴处理对UBCE2基因表达发挥正向诱导作用。Wang等（2014）研究发现，番茄中2个E2基因（SlUBC32和SlUBC41）参与调控番茄果实成熟，但具体分子调控机制尚不清楚。Dong等（2016）通过研究香蕉花后果实不同发育阶段E2基因家族的表达情况发现，E2基因家族不同成员在果实发育不同阶段行使功能，推测这些基因在果实发育过程中发挥关键作用。陈曙等（2018）通过研究低磷处理下玉米幼苗不同组织中E2基因的表达情况发现，ZmUBC17基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，推测ZmUBC17基因是通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率。Nurdiani等（2018）研究发现，水稻OsSCE1基因（LOC_ Os10g39120）在日本晴中过表达从而降低了植株对干旱胁迫的耐受性，而敲除OsSCE1基因后其耐旱性略升高，表明该基因可能在水稻干旱胁迫中起到负调节作用。【本研究切入点】目前鲜见有关妃子笑荔枝花穗发育过程中E2基因（LcUBC12）表达的相关研究报道。【拟解决的关键问题】基于本课题组前期烯效唑处理的荔枝花穗发育转录组（RNA-seq）数据，从中筛选出LcUBC12基因，利用本地BLAST从荔枝基因组中查找出该基因cDNA全长，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测LcUBC12在妃子笑荔枝不同组织及烯效唑处理下花穗不同发育阶段的表达情况，分析该基因在调控妃子笑荔枝花穗发育中的作用，为研究E2响应烯效唑的作用机制及泛素化修饰在调控妃子笑荔枝花穗发育中的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料为妃子笑荔枝，种植于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝栽培示范园。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒（北京华越洋生物科技有限公司）、cDNA反转录试剂盒（Thermal Fisher Scientific公司）和SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]。主要仪器设备：实时荧光定量PCR仪（罗氏LightCycler，北京龙跃生物科技发展有限公司）。

1. 2 样品采集及处理

采集妃子笑荔枝的根、茎、叶、雌花、雄花、果肉、果皮和种子等组织。此外，随机选择树龄相同、长势相近的妃子笑果树6株，当花穗抽生至约18 cm时，对整个树冠喷施50 mg/L烯效唑（有效成分含量5%），喷至叶面滴水，对照不作任何处理。完全随机区组排列，单株小区，3次重复。追踪花穗和果实发育动态，分别在0、7、14、28、35和42 d取花穗样品，用液氮速冻后于-80 ℃保存，用于后续RNA提取。

1. 3 生物信息学分析

基于妃子笑花穗RNA-seq数据（GenBank登录号SRP092890）（Wei et al.，2017），筛选获取荔枝LcUBC12基因转录本，利用本地BLAST查找荔枝基因组中该基因的cDNA序列全长，对其编码蛋白（LcUBC12）进行生物信息学分析：利用ExPASy ProtParam和ProtScale预测其基本理化性质、Plant-mPLoc进行亚细胞定位、SMART预测保守结构域、SOPMA预测二级结构、SignalP 4.1 Server预测信号肽、ExPASy TMPred预测跨膜结构及NetPhos分析磷酸化位点。此外，利用NCBI数据库中的BLAST将LcUBC12蛋白氨基酸序列与其他物种的E2蛋白进行同源性比对。利用Clustalx 1.83进行多重序列比对。采用MEGA 6.0的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育进化树（1000次重复，其他参数均为默认）。

1. 4 qRT-PCR检测

参照植物总RNA提取试剂盒说明提取样品的总RNA，用RNase-free DNase消化去除DNA污染，利用核酸蛋白检测仪检测RNA质量和浓度。利用M-MLV逆转录酶反转录合成cDNA第一链。利用Pri-mer3plus设计LcUBC12基因的qRT-PCR引物（F：5'-AGCCGGGGAATTACGTCTTA-3';R：5'-ACCGT TGTCTTGCACTTAACC-3'）和内参基因（GenBank登录号HQ615689）引物（F：5'-GTGGTTCTACTATG TTCCCTG-3';R：5'-CTCGTCGTACTCATCCTTTG-3'），委托广州艾基生物技术有限公司合成。qRT-PCR反应体系20.0 μL：cDNA 1.0 μL（相当于25 ng总RNA），10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，ddH2O（无RNA酶）补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环。每个样品设3次重复。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以根和处理0 d花穗为对照。

1. 5 统计分析

利用Excel 2016进行数据处理，SigmaPlot作图。

2 结果与分析

2. 1 LcUBC12蛋白基本理化性质分析及亚细胞定位结果

从烯效唑处理的妃子笑花穗RNA-seq数据中筛选获取荔枝LcUBC12基因转录本（Unigene 0021028），通过本地BLAST从荔枝基因组中获得该基因cDNA的核苷酸序列全长，该基因编号为Litchi_GLEAN_10004716，将其命名为LcUBC12。该基因在基因组中编码区序列（CDS）全长为519 bp，编码172个氨基酸，其编码蛋白的分子量19.68 kD，分子式C879H1363N237O260S8，等电点6.52，不稳定指数35.70，为稳定蛋白，脂肪指数70.23，亲水性的平均值为-0.734，存在明显的疏水区和亲水区，疏水氨基酸的最大值（1.311）小于亲水性氨基酸的最大值（-2.944），且亲水性氨基酸总数为127个，比疏水性氨基酸总数（36个）多，为亲水蛋白（图1）。LcUBC12蛋白亚细胞定位于细胞核。

2. 2 LcUBC12蛋白跨膜结构及信号肽预测

利用TMPred对LcUBC12蛋白进行跨膜结构预测分析，结果（图2）表明，LcUBC12蛋白不存在跨膜区。利用SignalP 4.1 Server的euk network算法对LcUBC12蛋白N端30个氨基酸进行信号肽预测，结果以氨基酸残基C/S/Y值表示，当C/S/Y平均分值>0.5时被认为存在信号肽，结果如图3所示。C/S/Y平均分值<0.5，推测LcUBC12蛋白不含有信号肽，可能在细胞质中合成，无蛋白转运功能，为非分泌型蛋白。

2. 3 LcUBC12蛋白结构域及磷酸化位点分析结果

如图4所示，LcUBC12蛋白包含典型的泛素结合酶UBC保守结构域（32～158 aa），并含有半胱氨酸活性位点，属于Class I家族E2蛋白。利用NetPhos 3.1 Server预测分析LcUBC12蛋白的磷酸化位点，结果（图5）显示，该蛋白可能存在的磷酸化位点中有5个丝氨酸（Ser）、4个苏氨酸（Thr）和3个酪氨酸（Tyr）。

2. 4 LcUBC12的蛋白二级结构预测结果

如图6所示，LcUBC12蛋白的二级结构主要包含α-螺旋（26.74%）、延伸链（18.60%）、β-折叠（6.98%）和无规则卷曲（47.67%）4种形式。其中无规则卷曲、α-螺旋和延伸链贯穿于整个氨基酸链，而β-折叠散布于无规则卷曲和α-螺旋附近。

2. 5 LcUBC12蛋白同源性比对和进化分析

将LcUBC12蛋白与其他13个物种UBC12蛋白进行氨基酸序列多重比对，结果如图7所示。LcUBC12蛋白与向日葵（Helianthus annuus，XP_022009656.1）、柑橘（Citrus sinensis，XP_006466720.1）、草莓（Fra-garia vesca subsp. vesca，XP_004300599.1）、萝卜（Raphanus sativus，XP_018466680.1）、甘蓝型油菜（Brassica napus，XP_013723962.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，XP_010531183.1）、芥菜（Brassica juncea，ACI16426.1）、莴苣（Lactuca sativa，XP_02375 9845.1）、芜菁（Brassica rapa，XP_009109342.1）、月季（Rosa chinensis，XP_024180934.1）、黄瓜（Cucumis melo，XP_008447054.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002525098.1）和菠菜（Spinacia oleracea，XP_ 021861377.1）的UBC12蛋白氨基酸序列的同源性分别为70.11%、68.16%、67.76%、67.03%、66.49%、65.59%、66.49%、66.67%、66.95%、66.12%、65.03%、65.57%和65.22%。LcUBC12与其他物种UBC12蛋白有高度保守的UBC结构域和相同的半胱氨酸活性位点。

荔枝为无患子科植物，但目前无患子科物种的UBC尚未见发表，因此只能与其他科UBC蛋白相比。利用MEGA 6.0构建上述物种UBC12蛋白的系统发育进化树，结果如图8所示。LcUBC12与芸香科的柑橘UBC12亲缘关系最近，其次是与菊科的向日葵和莴苣UBC12蛋白亲缘关系较近。同属于十字花科的萝卜、芜菁、甘蓝型油菜和芥菜UBC12蛋白也聚在同一分支上，再与隶属于十字花目的醉蝶花聚在一起，表明其亲缘关系較近;同属蔷薇科的草莓和月季UBC12蛋白也聚在同一分支上。可见，同科植物的UBC12蛋白亲缘关系较近。

2. 6 LcUBC12基因表達分析结果

qRT-PCR检测LcUBC12基因在不同组织中的时空表达模式及烯效唑处理下在花穗的表达情况。由图9可知，LcUBC12基因在不同组织中表达量排序为雌花>雄花>种子>果皮>叶>茎>根>果肉，尤其在雌花、雄花和种子的表达量明显高于其他组织，推测LcUBC12基因主要在花穗发育和生殖生长中发挥重要调控作用。由图10可知，烯效唑处理0～21 d LcUBC12基因在花穗中的表达量与对照无明显差异，烯效唑处理28 d其表达量明显低于对照，但烯效唑处理35 d其表达量上调，且较对照高，推测LcUBC12分别在对照和烯效唑处理的花穗发育过程中发挥不同的调控功能。

3 讨论

不同物种中含有不同数量的E2基因家族成员。目前，已从拟南芥（Kraft et al.，2005）、酵母（Michelle et al.，2009）、番茄（Wang et al.，2014）、玉米（Jue et al.，2015）、水稻（Zhiguo et al.，2015）和香蕉（Dong et al.，2016）中分别鉴定出14、50、39、75、52和72个E2基因家族成员。本研究通过分析荔枝品种妃子笑的花穗RNA-seq数据，共筛选到33个E2基因，其中LcUBC12基因在转录组中RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads，每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）值较高，通过LcUBC12基因生物信息学分析发现，LcUBC12蛋白包含典型的泛素结合酶UBC保守结构域（32～158 aa），并含有半胱氨酸活性位点，属于Class I家族E2蛋白，亚细胞定位于细胞核。此外，不同物种E2基因序列高度保守，由于无患子科其他物种UBC蛋白尚未见发表，本研究将LcUBC12蛋白与其他科UBC12蛋白进行进化分析，结果发现，LcUBC12蛋白与柑橘UBC12蛋白（XP_006466720.1）亲缘关系最近。E2作为植物蛋白泛素化降解途径中的关键酶在植物生长发育过程中发挥重要作用，通过分析该基因的时空表达模式，有助于了解E2基因在生物体中潜在的功能。前人研究证实，在植物不同组织中E2基因均有表达，但不同组织间的表达量存在差异，例如石斛DoUBC24基因在不同组织中的表达量排序为花>茎>种子>根>叶（安红强等，2016）;巴西橡胶树中HbUBC5基因在花中的表达量仅次于树皮（朱家红等，2014），香蕉中MaUCE1基因在花和果实中的表达量均较高（王园等，2010）。本研究结果与上述前人研究结果相似。LcUBC12基因在不同组织中均有表达，但表达量存在差异，具有组织特异性，其中在雌花、雄花、种子等生殖器官中的表达量较高，推测LcUBC12基因在妃子笑荔枝花穗发育和生殖生长过程中发挥重要作用，尤其是在花和种子的发育过程中发挥关键作用。在烯效唑处理花穗0～21 d，LcUBC12基因表达量与对照无明显差异，在35 d时其表达量达到高峰，而对照在28 d时表达量达到峰值，可见，烯效唑处理LcUBC12基因出现表达峰较对照晚7 d，表明烯效唑作为生长延缓剂，可导致LcUBC12基因表达峰延迟，且烯效唑处理35 d时的表达量远低于对照28 d的表达量，推测烯效唑处理后LcUBC12基因对花穗发育发挥负调控作用。当无烯效唑处理（对照）时，LcUBC12基因在花穗发育28 d时表达量最高，42 d时表达量最低，推测LcUBC12基因在花穗发育的28 d时高效表达，发挥正向调控作用，今后可通过转基因验证LcUBC12基因在花穗发育中的功能。

4 结论

LcUBC12基因具有组织表达特异性，在妃子笑荔枝雌花、雄花和种子中高效表达，推测其主要在花穗发育和生殖生长过程中发挥重要调控作用，但烯效唑处理后LcUBC12基因对花穗发育发挥负调控作用。

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（責任编辑 陈 燕）