N-cadherin在胆管癌组织表达及意义

张峰伟 杨自华 郭平学 常盼 于军 岳树强

(1.西安医学院第二附属医院肝胆外科，陕西 西安 710038;2西安医学院第二附属医院科研科，陕西 西安 710038;3.第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 710038)

胆管癌(Cholangiocarcinoma)来源于胆管细胞，发病隐匿且恶性程度高[1]。患者出现临床症状就医时往往病程至晚期，错过了最佳治疗时间。胆管癌近年在人群中的发病呈上升趋势，且其具有诊断困难、侵袭强、转移早、预后差等特点，因此研究促使胆管癌细胞发生侵袭转移的分子，以便早期控制胆管癌的进展成为亟待解决的问题。目前诸多临床研究[2]发现，细胞发生恶性侵袭的基础是上皮间质间转换(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，钙黏蛋白在EMT的发生时的表达变化明显。N-钙黏蛋白(N-cadherin)也称作钙粘着蛋白2(CDH2)，由906个氨基酸组成、位于人体18q11.2染色体上CDH2基因编码完成的分子量约140 kd的单恋跨膜糖蛋白[3]。已报道[4]N-cadherin在多种肿瘤中升高，如卵巢癌、胃癌、黑色素瘤等，如卵巢癌患者病情进展过程中，发生EMT，N-cadherin的表达增高，进一步促进了卵巢癌的侵袭转移及病情的发生发展。本研究将西安医学院第二附属医院和第四军医大学西京医院近五年的80例胆管癌患者的癌组织及癌旁组织为研究对象，探讨N-cadherin在胆管癌组织中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年1月至2019年6年在西安医学院第二附属医院和第四军医大学西京医院治疗并经病理科确诊进行手术切除的80例胆管癌组织及相应的癌旁组织(≥2 cm)，相应组织被切除后立即放入液氮罐中储存备用。所有临床资料均从原始病例本中获得。此次临床试验已经通过西安医学院第二附属医院和第四军医大学西京医院伦理委员会的审查(编号：L2011015)，患者均签署知情同意书。患者中男50例、女30例；年龄37～81岁、平均(59.02±9.39)岁；患者术前均未接受放化疗等治疗。严格按照国际抗癌联盟(UICC)颁布的第八版恶性肿瘤TNM分期标准进行胆管癌的TNM分期[5]。

1.2实验方法 根据美国Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书，提取组织中的总RNA：液氮研磨将样本裂解后，进行抽提、漂洗及洗脱操作。总RNA分离后用Nano Rrop 2000检测，日本Takara公司反转录试剂盒获互补DNA。SYBR Green I法进行q-PCR分析。检测胆管癌组织的N-cadherin mRNA水平，内参为GAPDH mRNA的表达水平。引物列表如下：N-cadherin上游引物5’-TGAAGTCCCCAATGTCTCCA-3’；N-cadherin上游引物5’-GCATCATCATCCTGCTTATCC-3’；GAPDH上游引物5’-AAGGTGAAGGTCGGA GTCAA-3 ’，GAPDH下游引物5’-GGAAGATG GTGATGGGATTT-3’。结果均重复3次取平均值后进行分析。

2 结 果

2.1胆管癌组织与癌旁组织的N-cadherin mRNA水平 RT-PCR结果显示，胆管癌组织中N-cadherin mRNA(3.42±0.98)的水平高于癌旁组织(2.05±0.64)，差异具有统计学意义(t=10.43，P=0.00)。且与癌旁组织相比较，80例中有72例胆管癌组中的N-cadherin mRNA升高，8例胆管癌组织的N-cadherin mRNA降低，见图1。

图1 胆管癌组织与癌旁组织中N-cadherin的mRNA比值

2.2胆管癌组织/癌旁组织中N-cadherin的mRNA比值与临床病理参数间的联系 结果发现N-cadherin mRNA在胆管癌组织/癌旁组织的比值与患者的性别、年龄无关(P>0.05)，而与患者的TNM分期、分化的程度、淋巴结转移及神经浸润有关(P<0.05)。见表1。

表1 胆管癌组织/癌旁组织中N-cadherin的mRNA比值与临床病理参数间的联系

2.3N-cadherin的mRNA对胆管癌的诊断价值 结果发现胆管癌组织/癌旁组织的N-cadherin mRNA AUC面积为0.88，Cutoff值为2.50，诊断敏感性为83.75%，特异性为77.50%，P=0.00。见图2。

图2 N-cadherin的mRNA对胆管癌的诊断价值

3 讨 论

胆管癌属于胆道系统高发、侵袭强、预后差的恶性肿瘤，近年来可能由于人们生活习惯及居住环境的改变，发病率逐年递升[6]。现代生物学研究表明，肿瘤细胞向周围组织侵袭是肿瘤转移的基础，与细胞间的粘附功能有关。EMT的基本条件是细胞形态、粘附及迁移力的变化，具体分子表现包括N-cadherin的表达上调等。基于EMT在肿瘤发生中的重要作用，有可能成为治疗胆管癌的新靶点。N-cadherin最初在神经细胞及纤维母细胞上被发现，N-cadherin的胞内片段与存在于细胞骨架上的连环蛋白相互作用，胞外同相邻细胞上的同种分子相互连接，不仅向细胞内传导信号，还参与细胞间的粘附功能。目前发现N-cadherin的表达异常增高促进前列腺癌血管生成、增强黑色素瘤、卵巢癌、食管癌等细胞的侵袭能力[7]。有研究[8]报道上调黑色素瘤细胞中N-cadherin的表达时，癌细胞的侵袭能力明显增强；敲除黑色素瘤细胞中的N-cadherin基因时，癌细胞的细胞周期阻滞，停留在G1期。另有研究[9]分析骨肉瘤患者血液中N-cadherin时发现，N-cadherin表达水平高的患者预后明显差于N-cadherin表达水平低的人。其分子机制可能是：过表达的N-cadherin蛋白激活MAPKERK信号通、诱导MMPS基因的表达、加速肿瘤的血管形成、促进肿瘤细胞的生长及侵袭；此外，过表达N-cadherin与PDGFR、FGFR等分子相互作用激活PI3K、MAPK等信号通路，促进肿瘤细胞的分裂增殖，加速肿瘤的发生发展[10]。本研究结果发现，N-cadherin在胆管癌组织的表达明显高于癌旁组织，高、中分化组织的表达明显比低分化组织低(P<0.05)，提示N-cadherin与生物学行为有关，且分化越差，表达越高。此外，此次实验结果发现N-cadherin的异常表达与患者的年龄、性别无明显联系，但与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、神经浸润有关，且晚期N-cadherin的表达明显高于早期，提示N-cadherin与胆管癌的发生发展及侵袭转移密切相关。ROC结果显示：N-cadherin AUC面积为0.88，诊断敏感性为83.75%，特异性为77.50%，这些回顾性的研究提示N-cadherin 对胆管癌具有诊断价值，可能可以成为胆管癌治疗的新靶标基因，在临床前及临床科研的研究中发挥前瞻性的作用。

综上所述，N-cadherin mRNA在胆管癌组织的表达升高，且生物学行为越差、分期越晚，其表达量越高。