辽西驴细管冷冻精液制作的研究

张晓鹰，刘兴伟，张兴会，黄国卫，张立斌，武师良，王晓铭，邹丽娜，宋恩吉

（1.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，沈阳 110000；2.辽宁省建平县畜牧技术推广总站，辽宁 建平 122400；3.建平县动物疫病预防控制中心，辽宁 建平 122400；4.盖州市畜牧技术推广站，辽宁 盖州 115200）

近年来，辽西驴以耐粗饲、出肉率高、肉质鲜美、皮质好、出胶率高等深受市场的青睐，饲养数量逐年增加，养殖量居全国前列，已成为我国重要的肉驴生产及供种基地。为了做好辽西驴品种资源的保护利用，同时解决缺少优秀种驴等实际问题，辽西驴项目组于2019年6—8月开展了辽西驴细管冷冻精液的制作研究，并取得了良好成效。

1 材料与方法

1.1 精液来源

精液来源于建平县芮林牧业有限公司的4头种公驴。

1.2 试剂及药品

无机盐（分析纯）、糖类、乙二醇、甘油［1］等试剂及抗菌素等。

1.3 试验器材

400～600 倍光学显微镜［2］、离心机、恒温水浴锅、超低温温度仪、控温冰箱、电子天平、0.5 mL与0.25 mL细管［3］等。

1.4 试验方法

1.4.1 筛选冷冻稀释液 冷冻稀释液包括以乙二醇为防冻剂的初选配方，以等量甘油替代乙二醇为防冻剂的二次筛选配方，不同含量的防冻剂的优化配方。各配方具体成分见表1、表2、表3。

表1 初选冻精稀释液配方成分

表2 二次筛选冻精稀释液配方成分

表3 优化冻精稀释液配方成分

1.4.2 稀释液配制 原精离心液配制：蔗糖分析纯试剂110 g，加纯化水1 000 mL煮沸至蔗糖全部溶解。

冷冻稀释液配制：准桷称量各配方中的基础试剂，煮沸，溶解，制成溶液，常温冷却后加入抗菌素和卵黄，搅拌均匀。

1.4.3 精液离心与稀释 原精经纱布（6～8层）过滤［4］后，按1∶1体积比例加入离心液［5］，缓慢均匀混合后，装入离心管，在（30±4）℃范围内以2 000 r／min［6］离心10min；离心后精液弃去上清液后在干净的容器内按1∶1～1∶2加入冷冻稀释液，等温缓慢混匀。

1.4.4 降温平衡 稀释后的精液放入缓冲容器内，封口，进行降温平衡。

1.4.5 精液冷冻温度 初冻温度［7］分别设置为（90±5）℃、（100±5）℃、（110±5）℃、（120±5）℃、（130±5）℃、（140±5）℃共6组，当冻精细管变成乳白色时全部浸入液氮中。

1.4.6 细管冻精解冻及质量检测 解冻后，在37℃环境下检查活力、顶体完整率和存活时间［8］。

1.4.7 分析方法 采用SPSS软件进行统计分析［8］，用LSD法多重比较各处理的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同的稀释液初选配方冷冻效果比较（见表4）

表4 不同的稀释液初选配方的冷冻效果

从表4可以看出：C1配方的解冻后活力、冻后顶体完整率均最高。据此，以C1配方为首选配方。

2.2 冻精稀释液配方的第二次筛选（见表5）

从表5可以看出：用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂，冷冻后精子活力A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1；解冻后精子的解冻完整率A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1，冻精解冻后在38℃下存活时间A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1。上述情况表明，采用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂可以提高辽西驴细管冻精的综合质量。

表5 第二次筛选的冻精稀释液配方效果比较

2.3 优化稀释液配方中不同甘油浓度对冻精质量的影响（见表6）

表6 不同甘油浓度对冻精质量的影响

由表6可以看出：C23（甘油含量为5mL）冷冻后活力、冻后顶体完整率、存活时间都比其他组高，其中C23的精子冷冻后活力较C21相比差异极显著（P＜0.01），与C22、C25相比差异显著（P＜0.05），与C24比较差异不显著（P＞0.05）；C23冻后顶体完整率与C21、C22、C25相比差异显著（P＜0.05），与C24比较差异不显著（P＞0.05）；精子解冻后38℃下存活时间以C23组最高，与C21比较差异极显著（P＜0.01），与C22、C25比较差异显著，C23与C24比较差异不显著（P＞0.05）。综上所述，甘油的添加量以5 mL最为适宜。

2.4 不同的冷冻温度对冷冻效果的影响

使用C23配方配制稀释液，对不同的初冻温度下各组冷冻效果进行比较结果见表7。

表7 不同的冷冻温度对冷冻效果的影响

由表7可以看出：不同初冻温度的冷冻结果存在微小的差异，冷冻后活力以（100±5）℃～（120±5）℃较好，但各组间差异不显著。冻后的顶体完整率也存在同样的规律。因此，可以初步判定初冻温度应控制在（90±5）℃～（140±5）℃的温区内，温度过高或过低对冷冻结果均会造成不良影响。

2.5 不同的平衡时间对冷冻效果的影响

使用配方C23对原精进行稀释，利用冰箱低温保存稀释后的精液，将冰箱的温度设置为2℃，降温到2℃最短的时间为6 h，测定降温平衡后不同时间的细管冻精的解冻效果，结果见表8。

由表8可以看出：精液稀释后，在2℃下降温平衡10 h效果最好，解冻后精子活力从高到低依次为平衡10，8，12，18，14，6，16 h。平衡10 h与平衡8，12 h间差异不显著（P＞0.05），平衡10 h与平衡18，6，14 h间差异显著（P＜0.05）；精子顶体完整率各组间差异不显著（P＞0.05），但与精子解冻后活力的变化规律是相同的，即降温平衡10 h效果最好，从高到低依次为平衡10，8，14，16，12，18，6 h。精子解冻后38℃下存活时间以平衡10 h最长，18 h最短。由此所见，精液降温平衡时间过长或较短都不好，以6～12 h为宜，与山羊冻精平衡适宜时间（2～4 h）有较大区别。

表8 降温平衡时间对细管冻精效果的影响

2.6 不同的平衡温度对冷冻效果的影响

使用配方6对原精进行稀释，将控温冰箱的温度分别调整到0，2，4～5℃（允许上下波动0.5℃），通过调整温度缓冲容器内的细管精液量和包裹物层数等方法，使每份稀释后的细管精液在10 h降温到0℃和4℃，待温度稳定后进入冷冻程序操作，比较解冻后的精子活力及顶体完整率的变化，结果见表9。

表9 不同平衡温度对冷冻效果的影响

从表9可以看出：平衡温度以0℃组解冻后精子活力最好，其次为2℃组，4～5℃组最低，0℃组与其他两组间差异显著（P＜0.05）；顶体完整率比较，三组之间差异均不显著（P＞0.05）。解冻后38℃下存活时间，以0℃下平衡最长，4～5℃平衡时最短。可见在0℃下进行精液降温平衡，可以取得较好的冷冻效果。

2.7 不同的解冻温度对细管冻精质量的影响试验

将生产的同一批次的细管冻精按照试验要求分组，再使用不同温度的热水进行解冻，观察精子的存活情况，结果见表10。

由表10可以看出：辽西驴细管冻精解冻后活力、顶体完整率和解冻后在38℃存活时间各项指标随着解冻温度的提高而增加，表明高温解冻有利于精子的冻后复苏。考虑38℃、40℃解冻的各项指标与＞40℃解冻的各项指标差异性不大；高温解冻需要操作者操作快速、反应灵敏、对解冻的时间掌握得准确及时，才能收到好的效果；高温解冻在生产现场水温的保持有一定的困难，因此，以38～40℃的温水解冻为宜。

表10 不同的解冻温度对驴细管冻精质量的影响

2.8 不同容量细管精液冷冻效果比较（见表11）

由表11可以看出，0.25 mL细管与0.5 mL细管盛装辽西驴精液进行冷冻后，两组之间的解冻后活力、顶体完整率、解冻后在38℃存活时间等均无差异，说明二者可以通用。

表11 0.5 m L和0.25 m L细管冻精冷冻效果比较

3 结论与讨论

1）研究结果表明，以甘油为冷冻剂的配方（葡萄糖1.2 g、柠檬酸1.3 g、Tris 2.4 g、甘油5 mL、卵黄20 mL、双蒸水70 mL、青链霉素各1×105IU）可为制作辽西驴细管冷冻精液的首选配方。

2）精液降温平衡以时间8～12 h、温度0～2℃的冷冻效果最好；精液初冻温度在（90±5）℃～（140±5）℃的温区内冷冻效果最好。

3）冷冻精液解冻时，随着解冻温度的提高解冻效果也随着提高，建议以38～40℃的温水解冻较为适宜。

4）0.5 mL和0.25 mL细管冻精冷冻和解冻效果无差异，在生产实践中建议0.5 mL细管为宜。

本研究因季节限制没进行细管冻精受胎率试验，有待于进一步的试验验证。