鱼类性别调控机制的研究进展

韩 ，蔺佳文，韩 英

（东北农业大学，哈尔滨 150030）

脊椎动物的性别决定机制包括基因性别决定机制（genetic sex determination，GSD）、环境性别决定机制（environmental sex determination，ESD）和基因-温度性别决定机制（genetic sex determination+temperature effect，GSD+TE）［1］。由于进化水平的不同，其性别决定机制不同。遗传性别决定机制一般为进化程度较高的动物，如鸟类、哺乳动物等；而爬行类等较低等的脊椎动物，则是环境性别决定机制的代表；鱼类受基因、环境两种决定机制的影响，多数为基因-温度性别决定机制。

1 脊椎动物的性别决定机制

1.1 基因性别决定机制

基因性别决定机制是指动物的性别分化方向不受外部环境因素的影响，由性染色体上的遗传基因来决定。性别决定基因本身不参与性别的分化，只能控制其“决定过程”，并且启动一系列性别分化事件［2］。基因性别决定过程是一系列相互作用的复杂生化过程，该过程最终引起性细胞的决定和分化，途径内的某些成分或成分组合可能成为影响性别决定方向的主导因素。在大多数两性鱼类上也类似，性别决定过程通常是由性染色体上的单基因或者是多基因引起的一系列级联信号通路，诱导原始生殖性腺分化［3］。单基因是指动物的性别是由位于某条特定的染色体上的单个基因决定的，其他遗传基因座不会覆盖其影响；多基因是指由基因组中涉及性别决定的所有遗传因素共同参与了性别决定分化，位于同一染色体上或聚集在同一个基因座上［4］。此类作用机制同样存在于鱼类中。

鸟类和哺乳类等进化程度较高的脊椎动物，其性别决定机制就属于基因性别决定机制。基因性别决定机制分为两种：1）雌性同配（XX），雄性异配（XY），如哺乳类；2）雌性异配（ZW），雄性同配（ZZ），如鸟类（平胸类除外）。鱼类的性别决定机制原始、复杂，不同种类间的染色体类型存在很大差异，常采用基因标记法、人工雌核发育、诱发性逆转等细胞学以外的方法确定性别类型。鱼类的基因性别决定机制大致分为五类：雄性异配型（XY），大多数鱼类性染色体属于此类型，如虹鳟（Oncorhynchusmykiss）、胡子鲶（Clarias fuscus）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）等；雌性异配型（ZW），如半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）、剑尾鱼（Xiphophorus helleri）、大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）；雄性配子异配型（XX／XO），某一个性别少一条性染色体的鱼类，如褶胸鱼（Sternoptyx diaphana）；雌性配子异配型（ZO／ZZ），如短颌鲚（Coilia brachygnathus）；复 性 染 色 体 型（X1X1X2X2／X1X2Y），目前仅在鱼类中发现此类型，如花鳅（Cobitis taenia Linnaeus）等；常染色体型，如斑马鱼（Danio rerio）。

1.2 环境性别决定机制

低等的脊椎动物进化程度低，性别决定方式具有多样性。一些低等动物雌雄两种性别中的性染色体几乎没有差异性，有的甚至没能进化出所谓的性染色体，无法进行性别决定。因此在早期胚胎发育的过程中，温度或营养状况等外界环境因子的改变完全地覆盖或者取代了遗传因素的作用，成为性别决定和分化的重要影响因素［4］。在众多环境因子中，温度依赖型性别决定机制（temperature-dependent sex determination，TSD）最常见。温度依赖型性别决定机制是指环境温度在一定程度上可以影响动物的性别分化方向，一些爬行类如美洲短吻鳄、两栖类、鱼类如白氏银汉鱼（Atherina bleekeri Günther）就属于这种性别决定机制。TSD主要分为三种模式：第一种是FM模式，低温产生雌性后代，高温产生雄性后代，即Ⅰa型；第二种是MF模式，低温产生雄性后代，高温产生雌性后代，即Ⅰb型；第三种是FMF模式，高温和低温均产生雌性后代，中间温度产生雄性后代，即Ⅱ型［5］。例如，美洲短吻鳄卵在33℃下100%孵化为雄性，在30℃以下则雌性比例更高；乌龟卵孵化温度在20～27℃为雄性，在30～35℃为雌性［6］。

1.3 基因-温度性别决定

鱼类性别除了受性染色体上dmy基因、dmrt1、sf1、amh等常染色体上性别决定基因控制外，外界环境的影响也很大。其中温度性别决定机制（TSD）在环境因素影响中起重要作用。有试验证据的鱼类中仅有40种属于TSD型，其余19种鱼类为基因-温度性别决定机制（GSD+TE）［7］。鱼卵在孵化的过程中会出现一个特殊时期，称为温度敏感期（temperature sensitive period，TSP），在温度敏感期人为升高或降低温度可忽略遗传因素的影响改变性别分化方向和性别比例，甚至还会出现性别逆转现象。例如，尼罗罗非鱼在受精9 d后进入温度敏感期。在此期间进行高温36℃处理，一定比例的遗传性雌鱼会逆转为生理性雄鱼。经VASA免疫组织化学染色显示，高温处理的尼罗罗非鱼性腺在受精后21～39 d由卵巢型变为睾丸型；在受精后99 d高温处理的遗传性雌鱼的性腺变为真睾丸［8］。牙鲆（Paralichthys olivaceus）的温度敏感期为受精后30～100 d，研究表明，在此期间进行27℃高温处理，雌鱼100%性逆转为雄鱼，性逆转雄鱼的性腺Cyp19a1a基因表达受到抑制［9］。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）在20℃温度下进行正常的性腺分化，雌雄比例为1∶1；在25～30℃高温处理下，80%发育为雄性。许氏平鲉（Sebastes schlegelii）在温度较高时性腺偏雌性发育；反之性腺偏雄性发育［10］。

2 环境对鱼类性别决定的影响

相对于进化程度较高的脊椎动物稳定的性别决定系统，鱼类的性别决定更加灵活。鱼类的性别决定系统是以遗传为基础的，同时受环境因子的影响。这些环境因子包括生物和非生物两种因素。生物因素包括病原体等；而非生物因素则为水温、光照强度、外源激素、氧气含量、pH值等。这些环境因素都能在不同程度上影响鱼类的性别分化，其中温度和外源激素是目前最受关注且影响范围较广的两种环境因子，尤其在鱼类性别决定和分化的关键时期具有十分显著的作用。

2.1 温度对鱼类性别决定的影响

银汉鱼的性别分化遵循一种完全温度依赖型性别决定机制（TSD），高温下雄性比例大，而低温下雌性比例大。此外，大多数鱼类为基因-温度性别决定机制（GSD+TE），是在基因调控的基础上，改变环境温度使其中一部分性别分化方向发生改变。尼罗罗非鱼的性别决定系统主要是XX／XY，但是当在其温度敏感期进行高温36℃处理时，XX雌性罗非鱼会性逆转为生理性雄鱼，且无论温度进一步升高还是低温诱导，都不会进一步增加雄鱼比例。有研究证明，尼罗罗非鱼的温度敏感性为一种可遗传的性状［11］。在莫桑比克罗非鱼（Oreochromismossambicus）的温度敏感期进行20℃低温处理，会导致XY雄鱼逆转为生理性雌鱼。这说明不同种类的鱼对温度的敏感度不同。

2.2 类固醇激素对鱼类性别决定与分化的影响

性类固醇激素是影响鱼类性别决定与分化的首发因素之一，在雄鱼中指的是以睾酮为主的雄激素，在雌鱼中主要指的是雌激素和孕激素，它们影响生殖细胞及其他细胞的发育，参与性分化器官和第二性征的出现。内源性类固醇激素对鱼类性别分化影响存在着两种假说［4］；第一种是1987年由Bogart提出的平衡假说。该假说是指早期鱼体内雌雄激素比例决定鱼类性别，雌激素水平高则发育为雌性，反之则发育为雄性。研究表明，用40μg／g的17β-雌二醇处理出膜后3～20 d的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco），雌性率达到100%；用20 mg／kg的雌二醇处理出膜10 d后的黄颡鱼，雌性率达到83.6%［12］。另一种是缺失假说，即雌激素在鱼类性别分化中起关键性作用，若在鱼类性别分化关键时期有雌激素的合成，则为雌性，反之为雄性。例如，编码类固醇生成酶17β-羟基类固醇脱氢酶1（Hsd17b1）基因的错义SNP与梭鱼的ZZ／ZW 性别决定完全相关，Hsd17b1 mRNA在梭鱼未分化性腺和分化性腺中呈结构性表达，而W 型mRNA仅在基因型雌性性腺中表达，所以Hsd17b1等位基因的组合通过调节梭鱼的内源性雌激素水平来 决 定 性别［13］。此外，cyp19a1a、3β-hsd、P450scc、P450c17等雌激素合成相关基因在雄鱼苗内不表达，仅在雌鱼苗中表达。由此可见，在鱼类早期性别分化过程中首先出现雌激素，并且雄鱼体内没合成类固醇激素。

3 鱼类性别逆转研究现状

动物个体性别相互转化的现象称为性逆转，又称为性反转。脊椎动物中性逆转被认为是基因型和表型的错配，在鱼类的个体生长发育过程中温度、外源激素以及行为等均会影响鱼类的性别分化，使遗传性别发生逆转［4］。由于一些鱼类雌雄同体，鱼类中存在天然性逆转现象。先为雌性，即第一性成熟为雌性的卵巢，之后逆转为雄性的精巢，称为“首雌特征”，如石斑鱼类等；先为雄性，具有精巢组织，然后转变为雌性卵巢，称为“首雌特征”，如海产鲷科鱼类。雌雄异体的鱼类有些也会自然地发生性逆转，当前研究认为，斑马鱼性腺早期均为不成熟的卵巢，在受精后25～60 d内，雄性通过凋亡基因控制使卵巢凋亡并诱导其转化为睾丸，而雌性则通过抗凋亡基因途径来抑制凋亡［14］。随着现代育种技术的发展，可以利用外源因素人工诱导鱼类性逆转，将遗传性雄鱼诱导为生理性雌鱼或遗传性雌鱼诱导为生理性雄鱼，如在30 d牙鲆的饲料中添加10μg／g 17α-甲基睾酮70 d，雌鱼成功发生性逆转［9］。

3.1 诱导雄鱼性逆转研究

目前主要利用外源性雌激素来诱导雌鱼性逆转。常用的外源性雌激素有雌酮E1（Oestrone）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）、17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinyl estradiol）、EBA（Oestradiol butyryl acetate）、EB（Oestradiol benzoate）、乙烯雌酚DES（Stilbestrol）等。例如，雄性尼罗罗非鱼在17α-乙炔基雌二醇诱导下会发生完全性逆转。外源激素的使用方法分为急性方法和慢性方法两种。急性方法包括注射（肌肉或体腔）、投喂、浸泡或者混合使用；慢性方法包括饲料添加、制成胶囊或颗粒药物、埋植法等。每种方法均有优缺点，针对鱼类及外源激素类型决定。在鱼类性别决定早期进行外源激素的处理，可以诱导表型性别永久逆转。这个性别决定永久转换时期，称为性别敏感期。在对外源激素的敏感程度上，生理学性腺分化期最敏感，组织学性腺分化期次之。性别敏感期过后雄鱼会产生雄激素。因此，在利用外源激素诱导雄鱼性逆转时要掌握好性别敏感期，提高性逆转比例［15］。

3.2 诱导雌性性逆转的研究

雄激素可以使雌鱼发生性逆转现象。雌性虹鳟在雄激素处理后可以性逆转为雄性；尼罗罗非鱼、斑马鱼、大鳞大麻哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha）等甚至可以达到100%雄性率。常用的诱导雌鱼性逆转的雄激素类药物有17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）、17α-乙炔基睾酮（17α-ethinyl testosterone）和雄烯二酮（androstenedione）、11-KT（11-Ketotestosterone）、T（Testosterone）等。利用50μg／g MT处理雌性罗非鱼后100%逆转为雄性；用400μg／L MT处理孵化期的大鳞大麻哈鱼，也可以得到100%的转化率［16］。雌激素是诱导卵巢发育的重要因素，雌雄反转与雌激素水平的降低有着密不可分的关系。芳香化酶催化雄激素转化产生雌激素，在硬骨鱼类性腺分化中起重要作用，因此经常利用芳香化酶抑制剂来诱导雌鱼性逆转。芳香化酶抑制剂分为以下几种：雄烯二酮衍生物，如睾酮等；三唑衍生物，来曲唑（Letrozole）等；使用含有500μg／g法曲唑（Fadrozole）的饲料饲喂三斑海猪鱼（Halichoeres trimaculatus）雌鱼，饲喂5 d后卵巢发育异常，饲喂10 d后全部转变为雄性。芳香化酶抑制剂还可以使已经完成性腺分化的成年鱼发生性逆转，但是处理时间较长，如青鳉鱼等。常用的芳香化酶检测的方法有酶活性分析法、原位杂交法、RT-PCR和免疫组化法等。

3.3 性逆转与分子生物学研究

RNA-seq随着技术的成熟和功能的强大，已经广泛应用于鱼类转录组研究中。F.Y.Sun［17］等通过RNA-seq技术对斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）的精巢进行分析，共计鉴定出约25 307个功能基因，其中有167个为首次在斑点叉尾鮰中鉴定到的基因。在对精巢和卵巢的转录本分析中发现，Sox9、Dmrta2、Amh等为性腺发生、精巢的发育和精子发生的雄性偏向基因。在对密西西比铲鲟（Scaphirhynchus platorynchus）性腺的研究中发现，Dkk1和Dact1是仅存在于卵巢中的性别特异性基因，可以作为密西西比铲鲟性别分化和性腺发育研究中的性别标记。为了探究ERK和JNK两个MAPK家族中的两个主要亚族在黄鳝雌雄发育中的表达和定位，运用蛋白质免疫印迹杂交技术和免疫组织化学法对ERK和JNK进行检测。蛋白免疫印迹杂交结果显示，JNK的表达量低于ERK，ERK在黄鳝的雌雄性腺中均强表达。相比于精巢组织，JNK1在卵巢中表达更强，JNK2则在精巢、卵巢组织中表达差异不显著。免疫组织化学的研究结果显示，在精原细胞和卵原细胞中ERK和JNK呈阳性反应且定位类似；细胞质、细胞核核质呈阳性反应，核仁呈阴性反应。ERK和JNK在卵母细胞细胞质中的阳性反应随着卵母细胞的生长和成熟逐渐减退。该研究表明ERK和JNK在黄鳝的卵巢发育和凋亡，雄性发育的启动过程中具有重要作用［18］。Cyp19a1a是硬骨鱼中产生17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的关键基因。通过免疫组织化学方法和双荧光素酶测定法研究发现，Cyp19a1a在卵巢中的表达高于精巢。首次鉴定了一个miRNA，命名为360miR-26a-5p，研究表明它通过与Cyp19a1a直接进行相互作用，对E2进行调节，同时筛选出了在性逆转高表达量的miRNA候选基因［19］。

4 总结

随着对鱼类性别调控机制、性逆转现象和分子生物学的研究，人们对鱼类性逆转也有了许多新的认识。鱼类性别调控机制十分复杂，性逆转的影响因素也是多方面的。目前诱导鱼类性逆转的方法很多，但是有些理论基础仍然欠缺，许多方法仍然处于试验阶段，并不能大规模投入生产。笔者认为，鱼类性逆转的研究方向应集中在外源激素对鱼类性逆转的最佳诱导时期、利用模拟生态条件对鱼类性逆转进行调控、运用现在分子生物学技术探究有关鱼类繁殖和性逆转基因及作用途径，从而进一步研究鱼类性别调控机制和诱导鱼类性逆转方法。