五味子木脂素对哮喘模型小鼠Th2相关炎症因子的影响

孙靖辉，吕 希，王春梅，李 贺，陈建光

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性炎症性气道疾病，一般是由环境变应源介导而发生的疾病，在我国北方地区发病率较高，尤其是近年来，由于环境问题导致的空气质量下降，使得哮喘发病人群与日俱增[1].因此，如何有效地预防和控制哮喘的发生成为人们关注的焦点，探索安全有效的具有止咳平喘功效的药物成为药学研究的新课题.

屠呦呦曾提出“中国的传统医药是个伟大的宝库，应该努力挖掘并不断加以提高”，祖国传统中药历经几千年的印证，具有可靠的临床功效和安全性，应从中发掘寻找具有止咳平喘的药物，并运用现代药学方法进行验证.五味子是木兰科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)的成熟干燥果实，早在我国第一部中药典籍《神农本草经》中就有记载，且列为上品，是极具代表性的补益类中药[2].

本课题组多年来致力于五味子的开发和利用研究[3-4]，在对五味子的古方典籍进行整理的过程中发现，东汉张仲景所著的《伤寒杂病论》中共有12首方剂应用了五味子，纵观这12首方剂，凡见咳喘者则用五味子，反之，则不用，表明张仲景对五味子止咳平喘功效的肯定.五味子主要含有木脂素、多糖、有机酸及挥发油类成分，课题组前期研究[3-4]结果表明：五味子中的木脂素成分应该是其发挥止咳平喘作用的主要功效成分，因此，本研究通过卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)结合氢氧化铝诱导建立哮喘动物模型，采用五味子木脂素(Schisandrachinensislignans，SCL)作为治疗哮喘的药物成分，观察其止咳平喘功效和对Th2相关炎症因子的影响，为今后更深一步的研究奠定基础.

1 材 料

1.1 试剂与仪器

五味子木脂素(吉林省五味子开发及产业化工程研究中心)；卵清蛋白(OVA，Ⅴ级，Sigma公司，美国)；氢氧化铝(上海国药集团化学试剂有限公司)；免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-5(Interleukin-5，IL-5)Elisa试剂盒(武汉爱博泰克生物科技公司)；YLS-8A 多功能诱咳引喘仪(济南益延科技发展有限公司)；Infite M200多功能酶标仪(TECAN公司，瑞士).

1.2 实验动物

雄性BALB/c小鼠(6周龄，合格证号：SCXK(吉)2018-0007，长春亿斯实验动物科技有限公司)，体质量18～22 g，动物室温度20～24 ℃，湿度45%～55%，自由取食和饮水.

2 方 法

2.1 动物分组、模型建立和给药

72只小鼠随机分为3组，对照组(CON)、模型组(MOD)和五味子木脂素治疗组(SCL)，每组24只.在第1、8、15天对小鼠进行腹腔注射致敏，MOD组和SCL组给予0.2 mL致敏液(OVA 100 μg+氢氧化铝1 mg，溶于生理盐水中)，CON组给予相同体积的生理盐水.第22～29天MOD组和SCL组小鼠放入诱咳引喘仪中，以10 mL的2% OVA溶液雾化吸入，40 min/次，1次/d，用以激发致敏引起哮喘.CON组给予等体积的生理盐水雾化，SCL组在每次激发前1 h进行灌胃给药，剂量为30 mg/kg，1次/d，CON组和MOD组给予相同体积的蒸馏水.第30天乙醚麻醉后，每组选12只小鼠，摘眼球取血，之后摘取肺脏，另选12只切开颈部皮肤，暴露气管，经气管向肺内缓慢注射4 ℃生理盐水0.8 mL，后缓慢回抽，重复2～3次，收集肺泡灌洗液(Broncho alveolar lavage fluid，BALF).

2.2 IgE、IL-4和IL-5的测定

将血液样本和BALF样本以3 000 r/min离心10 min，提取上清液，运用酶联免疫吸附法(ELISA)按照试剂盒说明书测定血清中OVA特异性抗体IgE 和BALF中IL-4、IL-5的水平.

2.3 肺组织病理学检查

将肺组织固定在10 %福尔马林溶液中，室温下保存24 h，石蜡包埋，切成5 μm的切片，室温下苏木精-伊红染色10 min，在光学显微镜下对肺组织进行观察(100倍).

2.4 统计学分析

3 结 果

3.1 小鼠行为学的改变

在OVA致敏的1～21 d，各组小鼠没有明显差异，从第22天开始的雾化激发过程中，MOD组小鼠逐渐出现打喷嚏、抓耳挠腮、焦虑不安，甚至出现呼吸急促和大小便失禁等症状；SCL组小鼠也出现上述症状，但较MOD组减轻；而CON组小鼠则未出现上述症状.

3.2 IgE、IL-4和IL-5水平的测定结果

与CON组比较，MOD组的IgE、IL-4和IL-5水平明显升高(P<0.01)；与MOD组比较，SCL组的IgE、IL-4和IL-5的水平则明显降低(P<0.01).见表1.

表1 各组小鼠IgE、IL-4和IL-5水平

组别ρ(IgE)/(ng·mL-1)ρ(IL-4)/(pg·mL-1)ρ(IL-5)/(pg·mL-1)CON54.83 ± 4.219.24 ± 1.4312.25 ± 1.28MOD200.62 ± 11.38∗∗30.11 ± 2.37∗∗33.91 ± 3.09∗∗SCL98.55 ± 6.89##15.69 ± 1.91##16.44 ± 1.63##

注：**.与对照组比较P<0.01；##.与模型组比较P<0.01.

3.3 肺组织病理学观察结果

与CON比较，MOD组炎症细胞浸润明显，巨噬细胞和中性粒细胞显著增多，肺间隔内有炎症，血管充血、肿胀.而与MOD组比较，SCL组小鼠肺组织中炎症细胞浸润减少，血管充血、肿胀程度减轻.见图1.

4 结 论

过敏性哮喘是世界上最流行的疾病之一，哮喘发病率的增加是一个值得关注的问题[5].尽管已经研发出许多药物用于哮喘的治疗，但由于其相关的不良反应，许多药物的使用受到了一定限制.因此，我们越来越需要开发毒副作用小的有效药物进行预防和治疗哮喘.当前，许多研究者已经发现多种天然中药对于治疗过敏性哮喘有一定的效果，然而难以确定哪一种中药在治疗过敏性哮喘方面更合适、更有效.在这项研究中，我们结合之前的研究结果，选取了中药五味子中的木脂素，观察其对哮喘诱导的肺部炎症的影响.通过给予小鼠OVA联合免疫佐剂Al(OH)3预致敏，之后再用OVA每天雾化激发诱导产生哮喘，这一方法是目前较为经典的诱喘动物模型建立方式[6].在本研究中，发现MOD组小鼠出现明显的过敏性哮喘的行为学特征，如打喷嚏和呼吸急促等，而经过SCL给药的小鼠则有明显的缓解，说明SCL能够在一定程度上减轻过敏性哮喘的症状.肺部组织的病理学观察结果显示，SCL可有效改善哮喘小鼠肺部炎症和血管的充血及肿胀等问题，说明SCL能够缓解哮喘发病过程中呼吸系统的炎症反应.

哮喘是一个复杂的生物学过程，与Th2细胞密切相关[7].Th2细胞通过分泌包括IL-4和IL-5在内的Th2细胞因子，在调节哮喘炎症中发挥重要作用[8].其中，IL-4具有多种活性，包括未成熟T细胞向Th2细胞分化和诱导B细胞转变产生IgE[9]，IgE是治疗哮喘的关键靶点，是过敏反应进展过程中最重要的因素之一.以往的研究[10]表明：降低IgE的水平可能对过敏性疾病有效，而IL-5也被认为是重要的招募嗜酸性粒细胞和嗜碱性细胞的因子，在炎性细胞从血管进入肺组织过程中起着重要的作用，3种因子相互关联激发导致哮喘的发病.从本研究的Th2相关炎症因子的实验结果来看，SCL组给药后，与MOD组比较，明显降低了小鼠BALF中IL-4、IL-5和血清中IgE的水平，哮喘的相关症状得到缓解，说明SCL能够通过降低Th2相关炎症因子而发挥减轻哮喘发病的效力.

此结果为五味子木脂素今后在治疗哮喘方面的研究提供了数据及实验的基础支持，但是在哮喘发生过程中的其他致病因子、通路机制和生物途径的研究则需要进一步的实验筛查论证，同时五味子木脂素包含多种木脂素单体成分，其中真正发挥平喘作用的成分也没有完全显现，需要进一步深入的筛选和验证.