黄芩射干汤主要黄酮类成分与H7N9病毒神经氨酸酶的分子对接

刘志强

(1.鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁，458030； 2.鹤壁市天然药物研究与开发重点实验室,河南 鹤壁,458030)

黄芩射干汤首见于翁藻的《医钞类编》,全方由黄芩、射干两药配伍而成,主治肺胃热毒壅盛所致的喉中腥臭等病[1]。药材黄芩为唇形科植物黄芩的根,富含黄酮、萜类、挥发油、多糖等,其最主要的药效物质成分为黄酮类，具有解热、抗炎、抗菌以及抗病毒等药理作用[2]。药材射干为鸢尾科植物射干的根茎,主要含有鸢尾苷、鸢尾素等黄酮类,具有抗炎、抗氧化、雌激素样作用,且抗菌抗病毒效果明显[3]。黄芩与射干均为常用清热解毒中草药,具有抗病毒活性,能抑制H7N9病毒的复制生长[2-3]。

H7N9病毒属于正黏病毒科、RNA病毒,具有外包膜,核衣壳为螺旋对称状颗粒,主要经呼吸道在人类之间进行传播,具有变异性和潜在大流行性风险[4-5]。其神经氨酸酶(neuraminidase)是该病毒复制、感染过程中的关键酶,也是扎那米韦、奥司他韦等抗流感药物阻断病毒感染和传播的主要靶酶[6]。神经氨酸酶活性位点高度保守,是抗流感病毒药物研究中的理想靶标,许多黄酮类等天然物质可以通过抑制神经氨酸酶产生抗病毒效应[7-8]。以往研究表明:H7N9病毒对奥司他韦、扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂敏感,而对利巴韦林、M2阻滞剂金刚烷胺等抗病毒药耐药[9],但目前研究发现,H7N9病毒的神经氨酸酶R292K、R152K，E119V和I222K/R的突变,会导致对奥司他韦、扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂耐药[10],因此,开发研究新一代抗H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂,提高对H7N9流感的防控治疗措施刻不容缓。

鉴于黄芩射干汤中黄酮类物质具有一定抗流感病毒作用,本研究利用分子对接技术将黄芩射干汤中主要黄酮类成分与H7N9病毒神经氨酸酶逐一对接,探究其抗病毒作用机制,为进一步研究黄芩射干汤抗流感病毒物质基础与药理机制提供线索与参考。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

(1)中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP[11](网址更新为:http:∥tcmspw.com/tcmsp.php)。(2)蛋白质数据库PDB(https:∥www.rcsb.org/)。(3)化学成分绘制软件ChemBio3D Ultra 14.0。(4)分子对接图像处理软件PyMOL。(5)分子对接软件AutoDock Vina与AutoDock Tools。

1.2 H7N9病毒神经氨酸酶准备

本研究以WU等[12]发现的扎那米韦与H7N9神经氨酸酶的共晶体为模型,将扎那米韦与H7N9神经氨酸酶用PyMOL分离,对神经氨酸酶进行前处理,去除水分子、磷酸根以及一些非活性位点的其他配体,利用AutoDock Tools对靶蛋白进行加氢、加电荷、设置为半柔性对接模式,统一转换为AutoDock Vina软件可识别的pdbqt文件。

1.3 黄酮类成分收集与前处理

检索CNKI数据库,查阅文献[13-16]收集黄芩射干汤中主要黄酮活性成分,黄芩含有汉黄芩素、黄芩苷、黄芩素、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶素A；射干含有白射干素、次野鸢尾黄素、芒果苷、射干苷、射干苷元、野鸢尾苷、野鸢尾黄素以及鸢尾黄素。本课题组以以上13种主要黄酮类成分为研究对象,研究黄芩射干汤主要黄酮类成分与H7N9神经氨酸酶分子对接情况。

利用TCMSP数据库下载以上13种活性成分的mol2格式文件,然后利用ChemBio3D Ultra 14.0软件进行能量最小化处理,最后利用AutoDock Tools将活性分子转换为AutoDock Vina软件可识别的pdbqt文件,以备分子对接使用。

1.4 分子对接方法

以扎那米韦的坐标为标准位点,设置活性口袋位置,将标准品扎那米韦进行分子对接,测试分子对接的准确性,研究扎那米韦的分子对接结合能、氨基酸残基作用情况。并以扎那米韦与H7N9神经氨酸酶作用情况为“金标准”,研究黄芩射干汤中主要黄酮活性成分与H7N9神经氨酸酶的分子对接结合能、氨基酸残基作用情况。

2 结果

2.1 分子对接结合能

如图1所示,扎那米韦与H7N9神经氨酸酶分子对接前后位置基本不变,说明AutoDock Vina分子对接准确性高,得到扎那米韦与H7N9神经氨酸酶分子对接结合能为-8.3 kcal/mol(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)。将13种主要黄酮类成分与H7N9神经氨酸酶逐个分子对接,结果如表1所示。从表1可见，大多数黄酮类成分与H7N9神经氨酸酶具有一定结合力,其中汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A与H7N9神经氨酸酶的结合能最佳,分别为-7.1，-7.2和-7.2 kcal/mol。如图2所示,汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A与H7N9神经氨酸酶分子对接位置基本重合、作用模式一致,表明黄芩射干汤抗H7N9的主要成分为汉黄芩素、黄芩素以及木蝴蝶素A。

图1 扎那米韦与H7N9神经氨酸酶结合情况 Fig.1 Combination of zanamivir with H7N9 neuraminidase

图2 汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A与H7N9神经氨酸酶结合情况Fig.2 Combination of hanbaicalin,huangqinsu,wood butterfly A and H7N9 neuraminidase

表1 黄芩射干汤主要黄酮成分与H7N9神经氨酸酶分子对接结合能
Table 1 The binding energy of main flavonoids components of huangqin-shegan decoction and H7N9neuraminidase molecular

中药来源黄酮类物质最佳结合能/(kcal·mol-1)黄芩汉黄芩素-7.1黄芩黄芩苷-4.5黄芩黄芩素-7.2黄芩千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷-5.8黄芩木蝴蝶素A-7.2射干白射干素-5.8射干次野鸢尾黄素-5.4射干芒果苷-6.9射干射干苷-1.6射干射干苷元-6.3射干野鸢尾苷-2.2射干野鸢尾黄素-6.0射干鸢尾黄素-6.4

2.2 分子对接情况

WU等[12]发现扎那米韦主要是通过与H7N9神经氨酸酶的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Glu-278，Lys-294和Arg-372等氨基酸残基相互作用,产生抑制作用。如图3～6和表2所示,扎那米韦、汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A能与神经氨酸酶活性位点上的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294产生相互作用,可能具有抑制H7N9神经氨酸酶的作用。

表2 研究药物与H7N9神经氨酸酶相互作用情况
Table 2 Study on drug interaction with H7N9neuraminidase

成分相互作用的氨基酸残基扎那米韦Arg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Arg-372,Tyr-406汉黄芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406黄芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406木蝴蝶素AArg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406

图3 扎那米韦与H7N9神经氨酸酶分子对接Fig.3 Zanamivir and H7N9 neuraminidase molecular docking

图4 汉黄芩素与H7N9神经氨酸酶分子对接Fig.4 Hanbaicalin and H7N9 neuraminidase molecular docking

图5 黄芩素与H7N9神经氨酸酶分子对接Fig.5 Huangqinsu and H7N9 neuraminidase molecular docking

图6 木蝴蝶素A与H7N9神经氨酸酶分子对接Fig.6 Wood butterfly A and H7N9 neuraminidase molecular docking

3 讨论与结论

计算机辅助药物设计、分子对接等新概念迅速发展,为药物研发注入了新的活力[17],本研究将黄芩射干汤中13种主要黄酮成分与H7N9神经氨酸酶进行了分子对接,发现汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A与H7N9神经氨酸酶结合能最高,能与神经氨酸酶Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294产生相互作用,具有类似扎那米韦样抗H7N9神经氨酸酶作用,这可能是黄芩射干汤抗H7N9病毒的药理学作用之一。汉黄芩素是从唇形植物黄芩、半枝莲等分离出的一种天然活性物质,具有显著抗病毒作用,能对乙肝病毒以及呼吸道合胞病毒产生抑制作用[10]。本研究分子对接发现,汉黄芩素能抑制H7N9病毒神经氨酸酶活性,说明汉黄芩素抗病毒效果确切。吴莹等[18]发现,汉黄芩素还能调控病毒感染的肺泡巨噬细胞NF-κB p62的核转移,减轻病毒导致的炎症反应,说明汉黄芩素具有抗炎、抗病毒等多靶点药理作用。黄芩素是从中药黄芩提取的一种黄酮类物质,对小鼠流感模型有明显抗病毒作用[19]。杨令芝等[20]发现,黄芩素不仅能抑制神经氨酸酶,而且对耐药型神经氨酸酶也具有明显的抗性作用,该报道与本研究结果相互佐证,表明黄芩素确能抑制神经氨酸酶作用。木蝴蝶素A与汉黄芩素是一对同分异构体[21],同为黄芩中的黄酮类活性物质,目前暂未见有关其具有神经氨酸酶抑制剂作用的报道,但本研究发现,其与H7N9病毒神经氨酸酶结合能为-7.2 kcal/mol,结合模式与结合能与黄芩素、汉黄芩素的相当,推测木蝴蝶素A亦能通过抑制神经氨酸酶活性发挥抗病毒作用。

综上所述,黄芩射干汤黄酮类成分抗H7N9病毒神经氨酸酶效果显著,其中汉黄芩素、黄芩素、木蝴蝶素A结合能最高,还具有一定抗炎作用,对耐药型神经氨酸酶也具有一定抗性。本研究基于中药有效成分配伍模式,以黄芩射干汤主要药效成分——黄酮类化合物为研究对象,分析了其抑制H7N9神经氨酸酶的分子机制,在一定程度上反映了黄芩射干汤抗H7N9病毒的药理作用。但鉴于中药汤剂化学成分复杂、计算机技术与现实的差异,黄芩射干汤抗H7N9病毒的更深层次药理机制仍待进一步深入研究。