田葱抗氧化活性组分筛选与低极性成分GC/MS分析

孙雪萍 刘振杰 谭小明 柴玲 刘布鸣

[摘要] 目的 篩选广西特色壮药田葱抗氧化活性组分，研究田葱低极性部位的化学成分。 方法 田葱乙醇粗提物浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对粗提物进行萃取得到相应有机相组分。运用酶标仪考察田葱粗浸膏和各个有机相浸膏对ABTS自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力，对石油醚部位成分进行气相色谱法-质谱法联用（GC-MS）分析，运用峰面积归-化法计算各成分的相对百分含量。 结果 田葱各萃取相均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯相抗氧化活性较好，清除ABTS、DPPH和超氧阴离子自由基的IC50值分别为697.7、742.2 μg/mL和705.8 μg/mL，与阳性对照维生素E的IC50值相当。GC-MS方法从田葱石油醚相中分析鉴定了41个化合物，有机酸类含量最多（53.59%）。 结论 田葱低极性部位主要成分为不饱和脂肪酸、萜类和甾体类，所有化合物均为首次从田葱中发现。体外抗氧化活性较好的组分主要集中于乙酸乙酯相，为田葱作为天然抗氧化剂的应用提供研究基础。

[关键词] 田葱;抗氧化;气相色谱法-质谱法联用;化学组成

[中图分类号] R284          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（a）-0045-06

Screening of antioxidant active components and the GC-MS analysis of the low polar components from Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner

SUN Xueping1   LIU Zhengjie1   TAN Xiaoming1   CHAI Ling2   LIU Buming2

1.College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning   530200， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Standards，Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning   530022， China

[Abstract] Objective To screen out the antioxidant components of Guangxi Zhuang medicine Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner， and to analyze the chemical composition of the low polar components. Methods The ethanol crude extraction of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner was dispersed in water and extracted by petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol to obtain the relative components，respectively. The antioxidant activities of the crude extraction and the organic phase extractions including ABTS，DPPH，superoxide and hydroxyl free radical scavenging ability were investigated by microplate reader. And the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to analyze the low polar components. The relative percentage of each component was calculated by peak area normalization. Results All the extracted phases of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner had certain antioxidant activity， among which the ethyl acetate phase had better antioxidant activity， and the IC50 values of ABTS， DPPH and superoxide radical were 697.7， 742.2 μg/mL and 705.8 μg/mL respectively， which were similar to the IC50 values of positive control vitamin E. Forty-one compounds were identified by GC-MS from the petroleum ether phase of the field onion， with the highest organic acid content （53.59%）. Conclusion The main components of the low-polarity parts of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner are unsaturated fatty acids， terpenes and steroids. All compounds are first discovered from scallions. The components with better antioxidant activity in vitro are mainly concentrated in the ethyl acetate phase， which provides a research basis for the application of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner as a natural antioxidant.

[Key words] Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner; Antioxidant; Gas chromatography-mass spectrometry; Chemical composition

田葱科田葱（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）属于单子叶植物，又名中葱、剪刀铰、水铰剪等。我国主要分布在广西、广东、福建、台湾，生长在湿地、水田、池塘和沼泽地上，是广西特色壮药之一[1]。据《中华本草》《中国壮药资源明录》[2]记载，其性味微咸（平），具清热利湿、解毒、治水肿、热痹、痔疮肿毒、脚气等功效。经文献调研可知关于田葱的相关报道极少。目前仅Bruce等[3]对田葱化学成分开展的研究发现，其含有丁香亭3-0-β-D-吡喃半乳糖甙、山柰酚3-0-二糖甙、异鼠李素3-0-葡萄糖甙、异鼠李素3-0-半乳糖甙、槲皮素3-0-葡萄糖甙、槲皮素3-0半乳糖甙、槲皮素3-0-芸香糖甙、丁香亭3-0-二糖甙等黄酮苷类成分。未见其他有关于田葱的物质基础与药理活性研究报道。本研究对田葱石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取相建立以ABTS自由基、DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力为指标的测定方法，进行田葱体外抗氧化活性研究，并对其清除能力进行分析，进而筛选出抗氧化活性较好的组分，对石油醚部位成分进行气相色谱法-质谱法联用（GC-MS）分析化学构成，对开发和综合利用田葱有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

田葱药材，采自广西防城港市大坪坡海边沼泽地，由广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为田葱（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）。样品标本存放于广西中医药大学药学院杨世林科研平台。

1.2 试剂

ABTS（1 g/瓶，批号：619H033）、DPPH（1 g/瓶，批号：464RB-GE）、维生素E（5 g/瓶，批号：720E033）、邻苯三酚（60 mmol/L，100 g/瓶，批号：712D022）和Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH=8.2，500 mL/瓶，批号：20181211）均由北京索莱宝科技有限公司生产，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;WJX-100高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）;HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）;Centrifug-e5810R台式离心机（艾本德中国有限公司）;DLSB-5/20低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）;SB-800 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;RE-2000A旋转蒸发仪（郑州世纪双科实验仪器有限公司）;Research plus移液枪（艾本德中国有限公司）;SYNERGY/H1酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.4 样品的前处理及提取物的制备

准确称取田葱药材10 kg，打粉，过2号筛，加95%乙醇浸泡，超声波辅助提取3次后进行抽滤，过滤，收集上清液及合并，减压回收乙醇。上清液经过旋转蒸发仪蒸发，浓缩成浸膏状的粗提物，然后分别用石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂后得出石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相4个不同组分的萃取相粗提物。

1.5 样品液的配置

准确称取3份0.03 g的4个萃取相的粗提物置于烧杯中，水相用蒸馏水超声溶解并定容至10 mL的容量瓶，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相用无水乙醇超声溶解并定容10 mL的容量瓶，摇匀，得到浓度为3200 μg/mL的母液。然后4个萃取相的母液依次按1600、800、400、200、100 μg/mL的浓度梯度来进行稀释，溶液备用。阳性对照品维生素E和样品的浓度一样，配置同上述样品母液一样。

1.6 抗氧化活性的测试

1.6.1 ABTS自由基能力的测定（ABTS法）  参照文献[4-5]方法并加以修改。用移液枪吸取不同浓度的样品液10 μL加入到96孔板中，然后再加入190 μL的ABTS储备液，混匀，避光反应15 min后于734 nm波长下测其吸光度。水相的空白对照以等量蒸馏水代替样品液，其他有机相的空白对照以等量无水乙醇代替样品液。每个样品平行3次，取平均值。计算公式如下：总抗氧化清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0为空白值的吸光度，A为样品的吸光度。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的测定  参照文献[6]方法并加以修改。用移液枪吸取50 μL不同浓度的样品液加到96孔板中，再加入50 μL的无水乙醇，最后快速加入0.25 mmol/L的DPPH溶液中，37℃恒溫避光反应30 min后于517 nm波长处测定其吸光度。水相的空白对照以等量蒸馏水代替样品液，其他有机相的空白对照以等量无水乙醇代替样品液。每个样品平行3次，取平均值。计算公式如下：DPPH自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0为空白值的吸光值，A为样品的吸光值。

1.6.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定（邻苯三酚自氧化法）  参照文献[7]方法并加以调整。用移液枪将1 mL不同浓度的样液加到96孔板中，再加4.5 mL的Tris-HCI缓冲液（50 mmo/L，pH 8.2），于室温下反应10 min后加入0.3 mL邻苯三酚溶液（3 mmol/L），避光反应5 min，最后加入1mL 8 mol/L的盐酸溶液来终止反应，于299 nm波长处测定其吸光度。水相的空白对照以等量蒸馏水代替样液，其他有机相的空白对照以等量无水乙醇代替样液。每个样品平行3次，取平均值。计算公式如下：超氧阴离子自由基清除率（%）=（A-A0）/A×100%。式中A为样品的吸光值，A0为空白的吸光值。

1.6.4 羟自由基清除能力的测定（水杨酸法）  参照文献[8]方法加以调整。用移液枪准确吸取不同浓度的样品液50 μL加到96孔板中，然后加入9 mmol/L的FeSO4溶液50 μL、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液50 μL，混匀，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液50 μL启动反应体系，于37℃水浴下避光恒温反应1 h，在510 nm波长处测定其吸光值。水相的空白对照以等量蒸馏水代替样品液，其他有机相的空白对照以等量无水乙醇代替样品液。每个样品平行3次，取平均值。计算公式如下：羟自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中：A0为蒸馏水（或者无水乙醇）代替样品的吸光度;A1为样品吸光度;A2为蒸馏水代替H2O2的吸光度。

1.7 数据处理

本实验采用Excel表格进行数据整理和绘图。以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图，使用回归分析方法求出清除率为50%时样品的浓度（IC50），使用IC50来表示样品的抗氧化活性结果。

1.8 甲醋化处理方法

取田葱石油醚相1 g，置于50 mL具塞烧瓶中，加石油醚（60～90℃）-苯（1∶1） 20 mL使其溶解，加0.4 mol/L KOH-甲醇溶液10 mL，摇匀，置于40℃恒温水浴1 h;加纯净水20 mL，振摇，静置待分层清晰后取上清液，经无水硫酸钠脱水，滤过，滤液作为供试品溶液[9]。

1.9 GC-MS分析条件

色谱条件：Agilent HP-5Ms毛细管色谱柱（30 nm×0.25 nm×0.25 μm）;初始温度120℃，保持3 min，以1.5 ℃/min升温至300℃，保持20 min;载气：He;流速：1 mL/min;进样量：0.2 μL;分流比：20∶1;离子源温度：230℃;四级杆温度：150℃;离子源：EI，电离能量：70 eV;进样口温度：230℃;离子源温度：230℃;扫描质量范围：35～450 amu。

2 结果

2.1 ABTS自由基清除能力的变化

田葱不同浓度的各萃取相对ABTS自由基清除率呈现出良好的量-效关系。使用回归分析方法得到回归方程，计算得到乙酸乙酯相的IC50值为697.7 μg/mL，与阳性对照维生素E的IC50（549.6 μg/mL）相当，正丁醇相、水相、石油醚相的IC50值较大（分别为1043.9、3209.3、7584.0 μg/mL），清除活性均较弱。见图1。

2.2 DPPH自由基清除能力的变化

田葱不同浓度的萃取相测定DPPH自由基清除率为4%～90%。使用回归分析方法得到回归方程，计算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分别为761.8、742.2 μg/mL，与阳性对照维生素E的IC50（539.2 μg/mL）相当，而水相、石油醚相的IC50值较大（分别为1 004 527.4、6872.2 μg/mL），清除活性均较弱。由此，各萃取相对DPPH自由基的清除能力从大至小依次为：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。见图2。

2.3 超氧阴离子自由基清除能力的变化

水相与其他几个相对超氧阴离子自由基比较，清除率最弱。使用回归分析方法得到回归方程并计算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分别为790.8、705.8 μg/mL，乙酸乙酯相的IC50值比阳性对照维生素E的IC50（779.3 μg/mL）低，而水相和石油醚相IC50值较大（分别为4652.9、1054.4 μg/mL），清除活性均较弱。因此各相对超氧自由基的清除能力由大到小依次为：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。见图3。

2.4 羟自由基清除能力的变化

田葱不同浓度的萃取相对羟自由基清除能力大小依次为：石油醚相、水相、正丁醇相、乙酸乙酯相，且呈量-效关系。使用回归分析方法得到回归方程，计算得到石油醚相的IC50值为4933.5 μg/mL，比阳性对照维生素E的IC50（3238.4 μg/mL）稍高，水相、正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值较大（分别为1 081 283.9、167 981.6、77 814 578.3 μg/mL），清除活性均较弱。见图4。

图4   田葱各萃取相对羟自由基的清除活性

2.5 田葱石油醚部位脂溶性成分的GC-MS分析总离子流图

对甲酯化处理以后的田葱石油醚相脂溶性成分进行GC-MS分析，各峰的保留时间和丰度值见图5。所得的质谱图通过Mass Hunter质谱工作站、NIST11标准质谱数据库检索，并按峰面积归一化法计算挥发油中各化合物的百分含量见表5。

3 讨论

体内高活性分子自由基產生过多，大量自由基积累导致氧化系统和抗氧化系统失衡[10]。抗氧化剂和抗氧化功能食品能够有效抑制自由基的氧化反应，从而有效预防各种与自由基相关疾病的发生[11-15]。研究显示[16-18]，传统合成抗氧化剂本身可能具有潜在毒性，在食品添加中要严格控制比例，以防对人体造成危害，所以开发安全性高、抗氧化能力强的天然抗氧化剂日益受到关注。从传统中药和民族药中寻找天然抗氧化剂，并对抗氧化活性成分及抗氧化机制进行阐释已成为近年来食品药品研究领域的热点和焦点[19-20]。本研究为系统研究壮药田葱体外抗氧化活性，筛选出抗氧化活性较好的组分，选取总抗氧化清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力为筛选指标。研究结果显示，田葱4个萃取相均有一定清除自由基的能力，是一种优良的天然抗氧化剂。乙酸乙酯相对ABTS自由基清除率IC50值为697.7 μg/mL，对DPPH自由基的IC50值为742.2 μg/mL，对超氧自由基的IC50值为705.8 μg/mL，可见田葱体外抗氧化活性较好的组分主要集中于乙酸乙酯相。

本研究以壮药田葱为研究对象，所采用4种方法均为中药在体外抗氧化活性筛选中常见的方法，简便、快速、准确。但是这些方法都是在非生理条件下进行的，这些结果不能外推为体内的结果[21-22]。因此，研究下一步将是采用细胞学实验和体内外实验相结合的方法综合评价田葱的抗氧化活性。

运用GC-MS方法，自田葱石油醚相中鉴定出的化合物百分含量占总峰面积的92.57%以上。分析结果可见石油醚相中有机酸类含量最多（53.59%），其中含量最高的为棕榈酸（23.57%），其次为亚麻酸（13.47%）、亚油酸（9.08%）和硬脂酸（2.99%）。甾体类化合物41含量也非常高（16.845%），其他成分主要为倍半萜类或者烯萜类化合物，τ-muurolol（2.368%）。

国内鲜见对中国传统壮药田葱活性物质和抗氧化活性的相关报道，所鉴定成分也均未在田葱中被报道过，研究结果丰富了田葱的化学成分，为该广西特色壮药的开发利用提供基础。许多疾病与自由基所引发的氧化作用有关，如风湿、糖尿病、衰老等症状[19-20]。本研究证实了田蔥具有一定的自由基清除活性，提示壮药田葱可作为一种良好的天然抗氧化剂，筛选出乙酸乙酯相的抗氧化活性较好，为从壮药田葱开发新的天然抗氧化剂提供参考数据和方法。

[参考文献]

[1]  张幼法，李修鹏，陈征海，等.发现于宁波的浙江省植物新记录—田葱科[J].浙江农林大学学报，2014，31（6）：990-991.

[2]  腾红丽，梅之男.中国中药资源明录[M].北京：中医古籍出版社，2014：377.

[3]  Bruce A，Bohm，F.William Collins. Flavonoids of Philydrum lanuginosum [J]. Phytochemistry，1975，14（1）：315-316.

[4]  喻巧容，黄锁义.不同极性薏苡仁提取物抗氧化活性研究[J].中国医药导报，2018，7（15）：19.

[5]  赵杰，杨仁华，罗文羲，等.灯盏乙素体外抗氧化活性的实验研究[J].昆明医科大学学报，2015，36（5）：1-4.

[6]  Yuan Y，Huang M，Pang YX，et al. Variations in essential oil yield，composition，and antioxidant activity of different plant organs from Blumea balsamifera （L.） DC. at different growth times [J]. Molecules，2016，21（8）：1024.

[7]  王寒，罗庆华，魏梦雅，等.大鲵油体外抗氧化活性研究[J].中国油脂，2018，43（9）：149-153.

[8]  李粉玲，蔡汉权，周从贤.西瓜皮多糖的超声波辅助提取及抗氧化性研究[J].韩山师范学院学报，2014，35（3）：45-51.

[9]  张赟赟，杨海船，李嘉，等.瑶药马蹄蕨中脂溶性成分的GC-MS分析[J].中国药房，2015，26（18）：2544.

[10]  曲柳青，高嘉唯，崔素萍，等.芸豆蛋白抗氧化组分在大豆油热氧化过程中的抗氧化作用[J].中国粮油学报，2019，34（2）：40-44.

[11]  张世倡，陈丽霏，温露，等.氧化应激的抗氧化机制及靶向应用[J].按摩与康复医学，2019，10（20）：65-67.

[12]  Takahiko I，Sena I，Daisuke M，et al. A novel free radical scavenger，NSP-116，ameliorated the brain injury in both ischemic and hemorrhagic stroke models [J]. J Pharmacol Sci，2019，141（3）：119-126.

[13]  刘志东，郭本恒，王荫榆.抗氧化活性检测方法的研究进展[J].天然产物研究与开发，2008，20（3）：563-567.

[14]  邓宇杰.茶树花提取物的抗氧化活性及其对HepG2细胞的抗增值活性[D].重庆：西南大学，2017.

[15]  严文琼，廖湘交，陈立勇，等.舒肝解郁胶囊联合喹硫平治疗首发精神分裂症的疗效及对氧化应激水平的影响[J].中国医药科学，2019，9（16）：79-83.

[16]  丁阳月，张林，崔月婷，等.电化学传感器在植物油合成抗氧化剂检测方面的应用[J].中国食品学报，2018，18（10）：302-307.

[17]  Eskandani M，Hamishehkar H，Jafar END. Cytotoxicity and DNA damage properties of tert-butylhydroquinone （TBHQ）food additive [J]. Food Chem，2014，（153）：315-320.

[18]  姚强.食用油脂中合成抗氧化剂的检测分析研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（15）：5104-5110.

[19]  张泽生，郭擎，高云峰，等.天然抗氧化剂的产业化进展[J].食品研究与开发，2017，38（7）：206-209.

[20]  郝鹏升，范嘉育，耿淑琴，等.数据分析技术在中药抗氧化谱效关系研究中的应用进展[J].中国现代应用药学，2019，36（7）：877-884.

[21]  赵贵.人体自由基及食药抗氧化作用[J].开卷有益-求医问药，2019（1）：57-58.

[22]  项敏泓，文杭，赵艳青，等.衰老在祖国医学的认识及其中药研究进展[J].中国医药导报，2019，16（9）：47-51.

（收稿日期：2019-11-18  本文编辑：刘永巧）