金黄色葡萄球菌的药靶基因预测

顾洪　廖毅　向小兵　曾凡才

[摘要]目的 利用生物信息学方法从基因层面筛选金黄色葡萄球菌（金葡菌）药靶基因。方法 应用Zcurve、Prodigal等软件重新注释金葡菌基因组并预测到61个漏注释基因，其次列出金葡菌的必需基因170个、高表达基因185个（20～205个）及基因组岛基因32个，通过同源比对排除人类及有益肠道菌群基因，最后在DrugBank上检索核查目标药靶。结果 通过反复筛选并排除肠道有益菌群后最终得到SAZ172_0418、SAZ172_0420、SAZ172_1976、SAZ172_1978、SAZ172_1980、SACOL1524、SA2981_1507、SA2981_2326、SA2981_2521、SA2981_1955共10个可作为药靶的基因。结论 筛选出的10个基因可对金葡菌耐药菌株的广谱抗菌药物研制提供理论帮助。

[关键词] 金黄色葡萄球菌;抗药性，细菌;基因组岛

[中图分类号] Q93-33[文献标志码] A[文章编号] 2096-5532（2020）04-0437-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.126

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200617.0946.001.html;2020-06-17 13：10

PREDICTION OF DRUG TARGET GENES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS

GU Hong， LIAO Yi， XIANG Xiaobing， ZENG Fancai

（Plastic and Burn Department， Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China）

[ABSTRACT]Objective To screen out the drug target genes of Staphylococcus aureus （S.aureus） using bioinformatics methods.Methods Zcurve， Prodigal， and other software were used to re-annotate S.aureus genome and 61 missed annotated genes were predicted. A total of 170 essential genes， 185（20-205） highly expressed genes， and 32 genomic island genes of S.aureus genome were listed. The genes of human and beneficial intestinal flora were excluded by homology comparison， and finally， the drug targets were searched and verified on DrugBank.Results After repeated screening and elimination of beneficial intestinal flora， 10 genes were finally obtained as the drug target genes， i.e.， SAZ172_0418， SAZ172_0420， SAZ172_1976， SAZ172_1978， SAZ172_1980， SACOL1524， SA2981_1507， SA2981_2326， SA2981_2521， and SA2981_1955.Conclusion The 10 genes screened out can provide a theoretical basis for the research and development of broad-spectrum antimicrobial agents for drug-resistant strains of S.aureus.

[KEY WORDS] Staphylococcus aureus; drug resistance， bacterial; genome island

金黄色葡萄球菌（金葡菌）可引起人体多部位多类型感染[1-2]。金葡菌也容易出现耐药菌株导致病人死亡率升高和住院时间延长，对人类健康威胁重大[3]。近年来金葡菌的耐药性成为全球医学关注的焦点[4]。生物信息学可利用数据库处理、选择、识别、验证和更新潜在药靶基因[5]。高表达、必需的、基因组岛基因和物种特有的基因更有可能成为有效药靶[6-7]。药靶基因有保守性与必需性，同时应与人类正常肠道菌群基因有差异[8-10]。本文将上述原则应用于金葡菌菌株，以求优化、分析筛选其药靶基因。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 数据收集

从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/） 中下载金葡菌（S.aureus）49种菌株的基因组及其注释信息。研究采用了2 767个细菌基因组进行重注释，这些基因组的注释信息与装配序列于2017年从Genbank上下载，它们的假定蛋白和非编码蛋白通过同源性搜索和Zcurve方法来重新注释。

1.2 重注释金葡菌基因组

应用Zcurve1.0[11]、Glimmer[12]和Prodigal[13]软件，使用联合预测的方法重新预测金葡菌的49种菌株基因组，識别了新的开放阅读框（ORFs），通过同源比对被注释为新基因，其中E值<1e-20，覆盖范围>80%，一致性>70%。

1.3 筛选高表达基因

从paxdb下载金葡菌的49种菌株蛋白表达数据。取最高表达的10%作为潜在的高表达基因[14]。高表达基因20～205个，平均值为185个。

1.4 挑选必需基因

从必需基因库DEG数据库下载（http：//www.essentialgene.org/）后挑选出49种金葡菌的菌株必需基因[15]。任取金葡菌菌株N315与金葡菌菌株NCTC交集得到必需基因1（176个）。再推广到金葡菌49种菌株得到共同必需基因170个。由此得到整个金葡菌群的共同必需基因。

1.5 确定基因组岛基因

从IslandViewer的网站（http：//www.patho-genomics.sfu.ca/islandviewer/query.php）获取已经测序的基因组岛。从中挑选出金葡菌的基因组岛序列，结合NCBI的同源Blast比对来确定其基因组岛基因32个。

1.6 寻找新的药靶基因

同时存在于必需基因与高表达基因的基因能够决定细菌的生存能力，加上基因组岛及预测到的新基因，再排除与人类及肠道菌群相似度高的基因，可以得到最终的药靶基因。最后利用DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）的序列检索核查药靶基因的同源临床药物。

2 结果

2.1 新基因

根据本文方法应用Zcurve1.0、Glimmer等软件从2 767个基因中预测到新基因61个。见表1。金葡菌新基因分别列出了61个新基因产物的功能。其中1562911-1563921、2671852-2672676、517534-517677的注释分别为GLPG、BL02347、RPMG2。GLPG为必需基因库DEG （http：//www.essential-gene.org/）收录的必需基因，是原基因注释文件中所缺失的。提示新基因注释能弥补原信息的不足。

2.2 基因组岛基因

用本文方法寻找到的基因组岛有6个，其中包含基因32个。见表2、3。将所有的基因组岛基因与新基因组合后结合NCBI的同源Blast确定基因名及COG编号、GI编号，得到基因52个。

2.3 高表达基因、必需基因

应用本文的方法结合DEG数据库寻找到的必需基因有170个。见表4。再与从paxdb下载并挑选到的前10%作为高表达基因，取高表达基因与必需基因交集。选择49种菌株交集结果中的重复在29（60%）株以上的基因共73个基因作为备选基因。见表5。取最高表达的10%作为潜在高表达基因以保持其密码子偏倚差异性。

2.4 同源性筛查后得到的基因

经过前面的步骤，最终得到125个基因，通过同源筛查出与人类、嗜酸乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌均不同源的基因，以保证药物对人类和人体有益肠道菌群无伤害作用，最后得到10个基因，其名称、序列及其蛋白功能见表6。

2.5 金葡菌潜在药靶基因的同源靶点及临床可能靶向药物

利用DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库首页的序列检索，以FASTA格式输入上述10个基因对应的蛋白序列，设置参数E值<20，过滤器中药物类型选择“已批准”，蛋白类型选择“靶向蛋白”，搜索。得到的结果有231种药物，本研究只探讨10个基因对金葡菌的抗菌作用及检测药靶基因预测的正确性，故只列出了8种临床较为常用的药物。见表7。

3 讨论

目前，抗生素靶向作用于金葡菌的蛋白质有潘顿-瓦伦丁杀白细胞毒素（PVL）、中毒性休克葡萄球菌毒素1（TSST-1）、α-溶血素、蛋白A（Protein A）、跨膜青霉素结合蛋白（pbps）、细胞壁应急刺激相关蛋白（CWSS）、酚溶性调节蛋白（PSM）、纤连蛋白结合蛋白和凝血酶、肠毒素等[16]。其中PVL由lukF-PV及lukS-PV基因编码，是一种具有细胞溶解特性并有助于葡萄球菌致病的成孔毒素。产生PVL的金葡菌菌株涉及原发性皮肤和软组织感染、高死亡率坏死性肺炎和复发性复杂性骨髓炎等疾病[17]。CWSS的代表基因包括murA、murZ、pbp2和tca等[18-19]，而纤连蛋白结合蛋白[20]和凝血酶的编码基因gyrA[21]以及肠毒素的编码基因sec[22]均为金葡菌的必需基因，其中sec同时为金葡菌的高表达基因[16]。本文研究结果显示，rpoB、rpoC基因属于高表达和必需基因，rpoB编码RNA聚合酶位于有催化活性的β亚基上，rpoB基因突变可能会影响整个RNA聚合酶的转录活性。基因交换的研究证实，RpoB-H481Y突变是导致万古霉素中介敏感金葡菌（VISA）表型出现的原因[23]。在VISA分离物中也发现了RNA聚合酶其他亚基的突变，如rpoD或本文中同属于高表达及必需基因的rpoC[24]。故本文高表达、必需基因结果对金葡菌的抗菌药物研究有一定意义。

基因组岛是通过水平基因转移的进化过程从同种族或异种族的生物中获得功能相关基因簇，具有抗生素抗性、细菌毒力相关的基因[25]。这种基因水平转移的进化如耐万古霉素金葡菌（VRSA，MIC>16 mg/L）[26]在分离接合过程中从耐万古霉素肠球菌上获取质粒，从VRE转座子Tn1546上编码的vanA操纵子上获得耐药性[27]，vanA编码产物使VRSA能够用d-Ala-d-Lac二肽取代d-Ala-d-Ala末端二肽，从而改变万古霉素的结合靶点，常常介导对万古霉素的高水平耐药[28]。

本研究通过重注释金葡菌基因组，筛选49种金葡菌菌株的高表达基因，重注释了金葡菌基因組获得新基因，筛选了基因组岛、必需基因，排除了与人类及肠道有益菌群同源基因得到10个潜在耐药药靶基因。本文在同源筛选中的E值为10～20，一致性<50%，覆盖范围<60%[29]。筛查后结果显示，SAZ172_0418基因来源于S.aureus subsp. aureus Z172菌株，蛋白质产物是ATP依赖性DNA解旋酶UvrD/PcrA，其分子功能有ATP结合、DNA结合、DNA解旋酶活性。同样是该菌株的另一基因SAZ172_0420被筛选出来，它编码Mutator家族转座酶，有转座酶活性，在DNA重组、换位中发挥作用，目前暂未命名。S14_ClpP_1基因产物ATP依赖性Clp蛋白酶蛋白水解亚基属于肽酶S14家族，酪蛋白溶解蛋白酶（ClpP）是ATP依赖性、高度保守的丝氨酸蛋白酶，该亚基有丝氨酸型内肽酶活性。HU等[28]研究显示，ClpP突变和功能丧失上调转录因子和细胞壁合成蛋白，如PBP2、FemA和FemB，可能会导致VISA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株产生，与本文筛选结果相一致。YmfN基因产物是多物种的多肽终止酶大亚基，含有N末端HTH结构域。McrA编码含有HNHc结构域的蛋白质（5-甲基胞嘧啶特异性限制性内切核酸酶McrA），有内切核酸酶活性及核酸结合的功能，是多细菌物种的HNH内切核酸酶。

YpbB基因在金葡菌COL中被篩选到，编码含有HTH_40结构域的蛋白质YpbB，含有C末端HTH域，目前功能未知。TPR repeat在金葡菌04-02981中，其编码菱形家族膜内丝氨酸蛋白酶，是蛋白酶、水解酶，是假定膜蛋白，含有TPR重复结构域。本文同种菌株中KilAC被筛选出来，在多物种中该基因编码氧化还原酶，其推定功能为噬菌体抗抑制蛋白或噬菌体抗抑郁蛋白YoqD、KilAC域。YjaZ目前推定的蛋白产物为金属钛酶，预测为锌依赖性蛋白酶YjaZ，DUF2268家族。FeoB在多物种的蛋白产物为亚铁转运蛋白B，功能为参与无机离子运输和新陈代谢。上述基因虽然部分功能未知，但其对金葡菌生长生存至关重要。

目前，临床上耐药金葡菌根据临床经验或药敏试验选用抗生素治疗失败后容易出现3种耐药结局：MRSA、VISA及VRSA，其中MRSA可通过药敏试验选用抗生素或最终应用万古霉素治疗;VISA及VRSA则无特效药。ZHANG等[30]研究认为，近年来万古霉素异质性耐药金葡菌（hVISA）/VISA的患病率有所增加，且亚洲国家比欧美国家更普遍。蛋白组学研究结果显示，许多蛋白质，包括参与金葡菌细胞壁合成、水解和转录调控的蛋白质是CLPC或CLPP的底物[31-32]，ClpP的缺失则会影响agr、sigB、sarT和walKR等几个重要调控基因的表达，从而降低金葡菌对万古霉素的敏感性[33]。推测本文筛选出的SAZ172_1976基因可能通过Clp蛋白酶作用于细胞壁影响金葡菌对万古霉素、青霉素及甲氧西林等抗生素敏感性。已有研究结果显示，ATP依赖性ClpP蛋白酶在真细菌和真核细胞的叶绿体和线粒体中高度保守，Clp相关蛋白和蛋白酶为金葡菌应激存活、毒力和抗生素抗性的核心[34]。本文研究结果与其一致。

本研究在DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库检索了金葡菌潜在药靶基因的同源靶点及可能靶向药物，列举了8种临床相关药物。尽管有研究显示多种细菌对三氯生耐药，但其对金葡菌表现出色的活性，可用于控制耐甲氧西林的金葡菌在医院中的传播[35]。DrugBank显示，磺酰胺通过与对氨基苯甲酸竞争结合四氢叶酸的中间体——二氢叶酸合成酶来抑制蝶啶和对氨基苯甲酸酶促转化为二氢蝶呤酸。嘌呤和dTMP的合成需要四氢叶酸，抑制其合成会抑制细菌的生长，磺酰胺的抗菌作用不受脓液中的对氨基苯甲酸影响。目前，临床烧伤科仍需将SAZ172_0420基因的靶向药物磺胺嘧啶和银离子的结合剂磺胺嘧啶银作为保痂抗菌一线用药。DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库检索结果显示，柠檬酸铋钾是靶向作用于幽门螺杆菌的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基ClpX。有趣的是，巴西FERRAZ等团队报道铋的化合物对金葡菌有抗菌活性[36]，而铋化合物是否靶向作用于Clp蛋白酶ATP结合亚基ClpX或其他蛋白有待进一步探究。

综上所述，本文的研究方法可作为多种微生物抗菌药物研制或更新的方法之一，本文筛选出的10个基因可对金葡菌耐药菌株的广谱抗菌药物研制提供理论帮助。

[参考文献]

[1]TONG S Y C， DAVIS J S， EICHENBERGER E， et al. Stap-hylococcus aureus nfections：epidemiology， pathophysiology，clinical manifestations， and management[J].  Clin Microbiol Rev， 2015，28（3）：603-661.

[2]BUSH K， LEAL J， FATHIMA S， et al. The molecular epidemiology of incident methicillin-resistant Staphylococcus aureus cases among hospitalized patients in Alberta， Canada： a retrospective cohort study[J].  Antimicrob Resist Infect Control， 2015，4：35.

[3]DE KRAKER M E A， DAVEY P G， GRUNDMANN H. Mortality and hospital stay associated with resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteremia： estimating the burden of antibiotic resistance in Europe[J].  PLoS Med， 2011，8（10）：e1001104.

[4]CHAMBERS H F， DELEO F R. Waves of resistance：Staphylococcus aureus in the antibiotic era[J].  Nat Rev Microbiol， 2009，7（9）：629-641.

[5]PERLMAN L， GOTTLIEB A， ATIAS N， et al. Combining drug and gene similarity measures for drug-target elucidation[J].  Journal of Computational Biology， 2011，18（2）：133-145.

[6]AGUERO F， AL-LAZIKANI B， ASLETT M， et al. Geno-mic-scale prioritization of drug targets： the TDR Targets database[J].  Nature Reviews Drug Discovery， 2008，7（11）：900-907.

[7]BUTT A M， NASRULLAH I， TAHIR S， et al. Comparative genomics analysis of Mycobacterium ulcerans for the identification of putative essential genes and therapeutic candidates[J].  PLoS One， 2012，7（8）：e43080.

[8]READ T D， GILL S R， TETTELIN H， et al. Finding drug targets in microbial genomes[J].  Drug Discov Today， 2001，6（17）：887-892.

[9]SAMAL H B， PRAVA J， SUAR M， et al. Comparative genomics study of Salmonella Typhimurium LT2 for the identification of putative therapeutic candidates[J].  Journal of Theoretical Biology， 2015，369：67-79.

[10]MEHLA K， RAMANA J. Novel drug targets for food-borne pathogen Campylobacter jejuni： an integrated subtractive genomics and comparative metabolic pathway study[J].  Omics： a Journal of Integrative Biology， 2015，19（7）：393-406.

[11]GUO F B， OU H Y， ZHANG C T. ZCURVE： a new system for recognizing protein-coding genes in bacterial and archaeal genomes[J].  Nucleic Acids Res， 2003，31（6）：1780-1789.

[12]KELLEY D R， LIU B， DELCHER A L， et al. Gene prediction with Glimmer for metagenomic sequences augmented by classification and clustering[J].  Nucleic Acids Res， 2012，40（1）：e9.

[13]HYATT D， CHEN G L， LOCASCIO P F， et al. Prodigal： prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification[J].  BMC Bioinform， 2010，11：119.

[14]SHARP P M， LI W H. The Codon adaptation index-a measure of directional synonymous Codon usage bias，and its potential applications[J].  Nucleic Acids Research， 1987，15（3）：1281-1295.

[15]LUO H， LIN Y， GAO F， et al. DEG 10， an update of the da-tabase of essential genes that includes both protein-codinggenes and noncoding genomic elements[J].  Nucleic Acids Res， 2014，42（Database issue）：D574-D580.

[16]HODILLE E， ROSE W， DIEP B A， et al. The role of anti-biotics in modulating virulence in Staphylococcus aureus[J].  Clin Microbiol Rev， 2017，30（4）：887-917.

[17]OKOLIE C E， COCKAYNE A， PENFOLD C， et al. Engineering of the LukS-PV and LukF-PV subunits of Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin for diagnostic and the-rapeutic applications[J].  BMC Biotechnology， 2013，13：103.

[18]MCALEESE F， WU S W， SIERADZKI K， et al. Overexpression of genes of the cell wall stimulon in clinical isolates of Staphylococcus aureus exhibiting vancomycin-intermediate-S.aureus genome-type resistance to vancomycin[J].  Journal of Bacteriology， 2006，188（3）：1120-1133.

[19]RAHMAN M M， HUNTER H N， PROVA S， et al. The Staphylococcus aureus methicillin resistance factor FmtA is a D-amino esterase that Acts on teichoic acids[J].  mBio， 2016，7（1）：e02015-e02070.

[20]ARCIOLA C R， CAMPOCCIA D， GAMBERINI S， et al. Prevalence ofcna， fnbA and fnbB adhesin genes among Staphylococcus aureusisolates from orthopedic infections associated to different types of implant[J].  FEMS Microbiology Letters， 2005，246（1）：81-86.

[21]GOOTZ T D， ZANIEWSKI R P， HASKELL S L， et al. Activities of trovafloxacin compared with those of other fluoroquinolones against purified topoisomerases and gyra and grla mutants of Staphylococcus aureus[J].  Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 1999，43（8）：1845-1855.

[22]JO A， AHN J. Phenotypic and genotypic characterisation of multiple antibiotic-resistant Staphylococcus aureus exposed to subinhibitory levels of oxacillin and levofloxacin[J].  BMC Microbiol， 2016，16（1）：170.

[23]MATSUO M， HISHINUMA T， KATAYAMA Y， et al. Mutation of RNA polymerase beta subunit （rpoB） promotes hVISA-to-VISA phenotypic conversion of strain Mu3[J].  Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2011，55（9）：4188-4195.

[24]MATSUO M， CUI L Z， KIM J， et al. Comprehensive identification of mutations responsible for heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus （hVISA）-to-VISA conversion in laboratory-generated VISA strains derived from hVISA clinical strain Mu3[J].  Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2013，57（12）：5843-5853.

[25]HIRAMATSU K， ITO T， TSUBAKISHITA S， et al. Genomic basis for methicillin resistance in Staphylococcus aureus[J].  Infect Chemother， 2013，45（2）：117-136.

[26]WEIGEL L M， CLEWELL D B， GILL S R， et al. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus[J].  Sci N Y N Y， 2003，302（5650）：1569-1571.

[27]ARTHUR M， MOLINAS C， DEPARDIEU F， et al. Characterization of Tn1546， a Tn3-related transposon conferring glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147[J].  J Bacteriol， 1993，175（1）：117-127.

[28]HU Q W， PENG H G， RAO X C. Molecular events for promotion of vancomycin resistance in vancomycin intermediate Staphylococcus aureus[J].  Front Microbiol， 2016，7：1601.

[29]GUO F B， XIONG L F， TENG J L L， et al. Re-annotation of protein-coding genes in 10 complete genomes of Neisseriaceae family by combining similarity-based and composition-based methods[J].  DNA Res： Int J Rapid Publ Rep Genes Genomes， 2013，20（3）：273-286.

[30]ZHANG S S， SUN X X， CHANG W J， et al. Systematic review and meta-analysis of the epidemiology of vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate Sta-phylococcus aureus isolates[J].  PLoS One， 2015，10（8）：e0136082.

[31]FENG J， MICHALIK S， VARMING A N， et al. Trapping and proteomic identification of cellular substrates of the CLPP protease in Staphylococcus aureus[J].  J Proteome Res， 2013，12（2）：547-558.

[32]GRAHAM J W， LEI M G， LEE C Y. Trapping and identification of cellular substrates of the Staphylococcus aureus CLPC chaperone[J].  J Bacteriol， 2013，195（19）：4506-4516.

[33]SHOJI M， CUI L Z， IIZUKA R， et al. WalK and CLPP mutations confer reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011，55（8）：3870-3881.

[34]FREES D， GERTH U， INGMER H. Clp chaperones and proteases are central in stress survival， virulence and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus[J].  International Journal of Medical Microbiology， 2014，304（2）：142-149.

[35]FAN F， YAN K， WALLIS N G， et al. Defining and combating the mechanisms of triclosan resistance in clinical isolates of Staphylococcus aureus[J].  Antimicrob Agents Chemother， 2002，46（11）：3343-3347.

[36]FERRAZ K S O， SILVA N F， DA SILVA J G， et al. Investigation on the pharmacological profile of 2，6-diacetylpyridine bis （benzoylhydrazone） derivatives and their antimony （Ⅲ） and bismuth （Ⅲ） complexes[J]. Eur J Med Chem， 2012，53：98-106.

（本文编辑 黄建乡）

[收稿日期]2019-11-18; [修订日期]2020-05-18

[基金项目]四川省科技厅自然科学研究计划项目（No.2013-SZZ001）;國家级大学生创新创业训练计划项目（01/01120354）

[第一作者]顾洪（1993-），男，硕士研究生。

[通信作者]曾凡才（1974-），男，博士，教授，硕士生导师。E-mail：zfcai@swmu.edu.cn。