APP下载

肝细胞癌亲环素J的表达及其作用

2020-07-04高红红王佳慧王志鹏陈剑

青岛大学学报(医学版) 2020年4期
关键词:细胞增殖肝细胞

高红红 王佳慧 王志鹏 陈剑

[摘要]目的 探讨亲环素J(CYPJ)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其作用。方法 应用UALCAN和cBioPortal在线网站分析CYPJ在HCC中表达及其与临床病理特征关系,并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测40例HCC进行验证。分析CYPJ在HCC中mRNA表达水平,并通过Kaplan-Meier生存曲线评估病人预后。将CYPJ-RNAi克隆入慢病毒载体(LV),并构建阴性对照(NC-LV),分别转染SK-Hep1细胞,qPCR方法验证转染效率。用MTT法检测不同感染复数(MOI)对SK-Hep1细胞生长的影响。结果 HCC组织中CYPJ mRNA表达高于癌旁正常组织(t=2.759,P<0.05),且与肿瘤病理分级有关(t=2.557,P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,CYPJ mRNA高表达病人预后差(χ2=9.464,P<0.01);通过沉默CYPJ基因表达可以抑制SK-Hep1细胞生长(t=3.231、8.976,P<0.01)。结论 CYPJ mRNA高表达在HCC生长过程中具有重要作用,并影响病人预后。

[关键词] 癌,肝细胞;亲环素J;细胞增殖;预后

[中图分类号] R730.261[文献标志码] A[文章编号] 2096-5532(2020)04-0404-05

doi:10.11712/jms.2096-5532.2020.56.080[HT]

[网络出版] http://kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0940.012.html;2020-04-18 16:48

EXPRESSION AND ROLE OF CYCLOPHILIN J IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA

GAO Honghong, WANG Jiahui, WANG Zhipeng, CHEN Jian

(Department of Oncology, the Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University, Yantai 264000, China)

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression and role of cyclophilin J (CYPJ) in hepatocellular carcinoma (HCC). [WTHX]Methods UALCAN and cBioPortal online websites were used to analyze the expression of CYPJ in HCC and its association with clinicopathological features, and the results were verified by quantitative real-time PCR analysis of 40 patients with HCC. The mRNA expression of CYPJ in HCC was analyzed and the Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate patients prognosis. CYPJ-RNAi was cloned into lentivirus vector (LV) and a negative control (NC-LV) was established, and then they were transfec-ted into SK-Hep1 cells, respectively. The transfection efficiency was verified by qPCR. MTT assay was used to observe the effect of multiplicity of infection (MOI) on the growth of SK-Hep1 cells. Results The expression of CYPJ in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue (t=2.759,P<0.05), which was associated with the pathological grade of tumor (t=2.557,P<0.05). The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with high expression of CYPJ tended to have poor prognosis (χ2=9.464,P<0.01). Silencing of the CYPJ gene inhibited the growth of SK-Hep1 cells (t=3.231,8.976;P<0.01).Conclusion High expression of CYPJ plays an important role in HCC tumor growth and affects patients prognosis.

[KEY WORDS] carcinoma, hepatocellular; cyclophilin J; cell proliferation; prognosis

原發性肝癌死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第3位,其病理类型中以肝细胞型多见。在我国慢性病毒性肝炎是肝细胞癌(HCC)的主要危险因素,HCC发生是一个多步骤的过程[1]。基因测序技术揭示了许多遗传变化,包括复发突变基因和信号通路失调[2],这些都与肝癌的发生和发展有关。但是肝癌仍然是一种致命的疾病,术后复发率高,关于其预测、诊断、治疗和预后监测仍有许多问题亟待解决[3]。亲环素家族(CYPs)在生物界广泛存在,其中亲环素A(CYPA)是发现最早、研究最深入的一个家族成员[4]。相关的研究结果已表明,CYPA 在许多恶性肿瘤组织中高表达,并与肿瘤生长、转移和耐药等密切相关[5-6]。新环素J(CYPJ)为近期研究发现的新成员,又称PPIL3,包括PPIL3a和PPIL3b 两条可变的剪切体[7]。CYPJ与CYPA序列相似度约为50%[8],参与免疫反应、细胞增殖和凋亡等过程[9-10]。然而,关于CYPJ在HCC的生物学功能尚不清楚。本实验研究CYPJ在HCC中表达情况及其与病人临床病理特征及预后的关系,并通过沉默CYPJ基因表达抑制SK-Hep1细胞生长,为评估病人预后和开发新的靶向药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 数据来源和分析

利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)在线网站,通过输入“PPIL3(CYPJ)”基因名称,分析 TCGA 数据库中HCC组织(371例)和癌旁正常组织(50例)中CYPJ mRNA表达情况,及其与临床病理分级的关系。利用cBioPortal(http://www.cbioprtal)在线网站,选择 TCGA 数据库中HCC,分析PPIL3表达情况与HCC病人预后的关系。

1.2 实验样本

HCC癌组织和癌旁正常组织样本40对,均来自烟台毓璜顶医院肿瘤科2012年3月—2013年4月收治病人,入组前未接受放疗或化疗。其中37例HCC病人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性,31例HCC病人有肝硬化。40例病人中男35例,女 5例;年龄40~71岁,平均(51.83±8.85)岁。电话随访,开始时间为病人确诊时间,结束时间为病人死亡或随访截止时间(2018年4月)。SK-Hep1细胞购自ATCC细胞库。本研究获得了病人或其家属的书面知情同意,并得到了我院伦理委员会的批准。

1.3 实验材料

RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司产品);Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司);MTT试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.4 构建慢病毒介导的CYPJ基因沉默

携带短发夹状干扰RNA(shRNA)的慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建,其正向序列为:gCTGGAAGAGGAGGCAACAG;其反向序列为:CTGTTGCCTCCTCTTCCAGc;接头序列为:TTCAAGAGA。含有3′dUdU的小干扰RNA(siRNA)片段si-CYPJ(5′-CUGGAAGAGGAGGC-AACA-3′)和si-control(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成,并用Blast进行序列对比,检测结果显示构建的si-CYPJ序列与其他CYPS的mRNA没有显著的同源性,连接病毒载体进行下一步实验。

1.5 细胞培养与转染

SK-Hep1细胞用25 cm×25 cm的培養瓶培养,置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中,培养基为含体积分数0.01胎牛血清的RPMI-1640 5 mL。取对数生长期的SK-Hep1细胞,经消化、离心,以每孔2×105个细胞密度接种于6孔板中。随机分为实验组和对照组,待细胞生长至70%融合时按照慢病毒转染试剂盒说明书进行转染。实验组转入CYPJ表达干扰的慢病毒(CYPJ-RNAi-LV组),对照组转入空载慢病毒(NC-LV组)。转染完成后于培养箱中继续培养,为后续实验做准备。

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织和细胞中CYPJ mRNA表达水平

取40对HCC癌组织和癌旁正常组织研磨,提取总RNA,逆转录为cDNA,加入引物进行qPCR。引物及其序列见表1。PCR的最佳条件为:95 ℃预变性5 min,扩增40周期(95 ℃、50 s,63 ℃、1 min,72 ℃、30 s),以25 μL体积(内含SYBR Premix Ex 12.5 μL,TapⅡ1 μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL,7.5 μL dH2O)进行PCR反应。实验重复 3 次,用2-△△Ct法计算HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA相对表达量。

细胞转染48 h后,收集CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞,提取细胞总RNA,检测各组CYPJ mRNA表达水平,实验步骤同上。实验重复3次。

1.7 MTT法检测沉默CYPJ对SK-Hep1细胞增殖的影响

取对数生长期的SK-Hep1细胞接种于96孔板,分为CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组,每组设3个复孔。将病毒上清液分别加入到各组细胞中,感染复数(MOI)设置为0、0.2、2.0、20.0和200.0,孵育96 h后,各组细胞每孔加入MTT溶液20 μL(浓度为5 g/L),置于培养箱中培养4 h,然后每孔加入Formazan溶解液100 μL,混匀并使结晶溶解,在细胞培养箱内继续孵育4 h。用酶联免疫检测仪检测各孔570 nm波长处光密度(OD)值,绘制细胞生长曲线,以细胞增殖率(ODCYPJ-RNAi-LV组/ODNC-LV组×100%)表示细胞增殖情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,计数资料结果以[AKx-D]±s形式表示,组间比较采用t检验;采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA表达水平比较

qPCR检测结果显示,40对HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA的相对表达量分别为0.894±0.422、0.668±0.303,HCC癌组织中CYPJ mRNA表达高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(t=2.759,P<0.05)。该结果与TCGA 数据库分析结果一致。见图1。

2.2 HCC癌组织CYPJ mRNA表达与临床病理特征关系

HCC癌组织中CYPJ mRNA相对表达量与病人性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、HBsAg、有无肝硬化和有无癌栓等无相关性(P>0.05),而与临床病理分级有关(t=2.557,P<0.05)。该结果与TCGA数据库分析结果一致。见表2。

2.3 HCC病人CYPJ mRNA表达与预后关系

以CYPJ mRNA表达水平中位数0.754为截点,将HCC病人分为低表达组和高表达组,采用Kaplan-Meier生存曲线分析显示,低表达组和高表达组生存时间分别为(53.8±10.1)、(36.1±14.2)个月;中位生存时间分别为55.3、28.9个月,5年生存率分别为55.0%、22.5%。Log-rank检验显示,低表达组病人的总生存时间(OS)较高表达组病人延长,两组比较差异有显著性(χ2=9.464,P<0.01),与cBioPortal在线网站分析结果一致。见图2。

2.4 CYPJ-RNAi-LV与NC-LV组细胞CYPJ mRNA相对表达量比较

CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞的CYPJ mRNA 相对表达量分别为0.414±0.047和0.846±0.542,两组相比较差异有显著意义(t=10.409,P<0.01)。

2.5 沉默CYPJ基因表达对SK-Hep1细胞生长的影响

MTT法检测结果显示,MOI为20.0、200.0时CYPJ-RNAi-LV组OD值明显低于NC-LV组,差异有统计学意义(t=3.231、8.976,P<0.01)。沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖。见图3。

3 讨论

HCC多起病隐匿,多数病人就诊时已属中晚期,术后复发和肝内外转移是导致HCC预后不良的主要原因,因此需要早发现和早治疗以提高治疗效果[11]。导致HCC发生的危险因素有很多,包括肝炎病毒(HBV或HCV)感染、病毒性肝炎、乙醇性肝硬化以及非乙醇性脂肪性肝炎等[12]。据统计约有80%的HCC病人是HBV携带者,这表明HBV感染在肝癌的发生、发展中具有重要作用[13]。有研究结果显示,早期HCC病人通过有效的治疗5年生存率可显著提高[14]。常用的肿瘤标志物为AFP,但其灵敏度和特异度较低[15]。随着基因组学和蛋

白质组学等技术的应用,有望获得特异性肝癌肿瘤标记物,为肝癌的早期发现提供依据[16]。CYPs家族具有肽基脯氨酰基顺反式异构酶(PPlase)活性和分子伴侣功能,在多种疾病中发挥重要作用[17]。其中,CYPA参与病毒感染[18]、炎性疾病[19]和肿瘤形成[6]等病理过程。CYPA与环孢素A(Cs A)具有高度親合力[17],二者在细胞内相互作用可以形成CYPA-Cs A复合物,该复合物可以阻断丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/p38信号通路的活化,从而抑制细胞的增殖[20]。另有研究发现,CYPA在非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达,可以促进细胞增殖、侵袭和迁移,p38抑制剂SB 203580可以抑制细胞的迁移[21]。在治疗晚期NSCLC病人时发现,Cs A与吉非替尼组合比单独应用吉非替尼更有效[22]。ZHAO等[23]研究发现,含喹喔啉的ZX-J-19及其衍生物ZX-J-19j和ZX-J-19l可抑制PPIase活性,对肿瘤细胞生长有显著的抑制作用,且效果比Cs A好。还有研究发现,HCC病人CYPA高表达与耐药相关基因的表达及化疗耐药产生有关[24]。这些研究表明,CYPA在肿瘤发生、发展中具有重要作用,并与耐药产生有关,而亲环素抑制剂在治疗肿瘤方面具有重要的意义。由于CYPA和CYPJ序列相似度高,可能在某些功能上极为相似,CYPJ在肿瘤发生发展中的作用值得探讨。

在2005年,已有研究者通过基因芯片技术将CYPJ作为差异性基因,从脑胶质瘤组织中筛选出来[25]。另有研究通过对11项全基因组相关研究进行分析发现,CYPJ(2q33)可作为乳癌的风险基因,该研究结果有助于提高乳癌家族发病风险的预测[26]。PHILIPPE等[27]的研究结果显示,亲环素抑制剂(CRV431)可以抑制亲环素PPlase的活性,从而抑制小鼠肝脏内的HBV DNA水平。HBV感染是HCC最常见的危险因素,这一研究结果为HCC治疗带来了启示。GONG等[28]应用免疫组化实验对120例胃癌组织和癌旁组织研究发现,CYPJ在胃癌组织中高表达,且与肿瘤分化程度有关,在肿瘤生长过程中具有重要作用。本研究通过UALCAN在线网站分析显示CYPJ在HCC中高表达,与临床病理分级有关,并通过qPCR实验进一步验证了数据库分析的结果。有研究结果表明,在癌细胞中CYPJ与凋亡蛋白相互作用,影响其发挥作用,为研究凋亡蛋白在细胞中的定位机制提供了新的方向[29]。SELMANSBERGER等[30]在对核辐射后甲状腺癌研究时发现,CLIP2参与细胞凋亡、MAPK信号传导和遗传不稳定性等致癌过程,且影响CYPJ的表达水平。本文研究结果显示,通过沉默CYPJ基因的表达可以抑制SK-Hep1细胞的生长,证明了CYPJ可以促进癌细胞增殖,其具体作用机制有待下一步实验。本研究结果还显示,CYPJ基因高表达HCC病人预后差,结果与cBioPortal在线网站分析结果一致。其次,本文结果还显示,沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖,并选择高效率MOI为后续实验做准备;CYPJ在肿瘤生长过程中具有重要作用,并影响病人预后。目前关于CYPJ在肝癌中作用研究较少,值得进一步研究。

总之,CYPJ基因在HCC癌组织中表达升高,并影响病人预后。沉默CYPJ基因表达可以抑制细胞增殖,其作用机制可能与MAPK/p38信号通路有关,有待下一步研究证实。CYPJ可能成为评估病人预后、开发新型抗癌药物的潜在靶点。

[参考文献]

[1]ISLAMI F, CHEN W, YU X Q, et al. Cancer deaths and cases attributable to lifestyle factors and infections in China, 2013[J].  Annals of Oncology, 2017,28(10):2567-2574.

[2]NIU Zhaoshan, NIU Xiaojun, WANG Wenhong. Genetic alterations in hepatocellular carcinoma: an update[J].  World Journal of Gastroenterology, 2016,22(41):9069-9095.

[3]WEN T F, JIN C, FACCIORUSSO A, et al. Multidisciplinary management of recurrent and metastatic hepatocellular carcinoma after resection:an international expert consensus[J].  Hepatobiliary Surgery and Nutrition, 2018,7(5):353-371.

[4]FENG Wenhua, XIN Yan, XIAO Yuping, et al. Cyclophilin a enhances cell proliferation and xenografted tumor growth of early gastric cancer[J].  Digestive Diseases and Sciences, 2015,60(9):2700-2711.

[5]QIAN Zhe, ZHAO Xiaoting, JIANG Mei, et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9[J].  BMC Cancer, 2012,12:442.

[6]NIGRO P, POMPILIO G, CAPOGROSSI M C. Cyclophilin A: a key player for human disease[J].  Cell Death & Disease, 2013,4(10):e888.

[7]ZHOU Z, YING K, DAI J, et al. Molecular cloning and cha-racterization of a novel peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)-like gene (PPIL3) from human fetal brain[J].  Cytogenetics and Cell Genetics, 2001,92(3/4):231-236.

[8]HUANG Lili, ZHAO Xuemei, HUANG Chaoqun, et al. Structure of recombinant human cyclophilin J, a novel member of the cyclophilin family[J].  Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 2005,61(Pt 3):316-321.

[9]SHENG Chunjie, YAO Chen, WANG Ziyang, et al. Cyclophilin J limits inflammation through the blockage of ubiquitin chain sensing[J].  Nature Communications, 2018,9(1):4381.

[10]CHEN J, LIEFKE R, JIANG L X, et al. Biochemical features of recombinant human cyclophilin J[J].  Anticancer Research, 2016,36(3):1175-1180.

[11]CHEN W Q, ZHENG R S, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J].  CA-A Cancer Journal for Clinicians, 2016,66(2):115-132.

[12]HLADY R A, ROBERTSON K D. Genetic and epigenetic he-terogeneity in normal liver homeostasis and its implications for liver disease and hepatocellular cancer[J].  Seminars in Liver Disease, 2018,38(1):41-50.

[13]LI Zhiqin, WANG Hongyan, ZENG Qinglei, et al. p65/miR-23a/CCL22 axis regulated regulatory T cells recruitment in hepatitis B virus positive hepatocellular carcinoma[J].  Cancer Medicine, 2020,9(2):711-723.

[14]VILANA R, FORNER A, GARCA A, et al. Hepatocellular carcinoma: diagnosis, staging, and treatment strategy[J].  Radiologia, 2010,52(5):385-398.

[15]WANG Ting, ZHANG Kunhe, HU Piaoping, et al. Combination of dual serum fluorescence, AFP and hepatic function tests is valuable to identify HCC in AFP-elevated liver diseases[J].  Oncotarget, 2017,8(58):97758-97768.

[16]LI Bo, LI Boan, GUO Tongsheng, et al. The clinical values of serum markers in the early prediction of hepatocellular carcinoma[J].  BioMed Research International, 2017, 2017:5358615.

[17]DAVIS T L, WALKER J R, CAMPAGNA-SLATER V, et al. Structural and biochemical characterization of the human cyclophilin family of peptidyl-prolyl isomerases[J].  PLoS Bio-logy, 2010,8(7):e1000439.

[18]KIM K, DAUPHIN A, KOMURLU S, et al. Cyclophilin a protects HIV-1 from restriction by human TRIM5α[J].  Nature Microbiology, 2019,4(12):2044-2051.

[19]GARIMELLA V, MCVOY J S, OH Unsong. The contribution of cyclophilin A to immune-mediated central nervous system inflammation[J].  Journal of Neuroimmunology, 2020,339(339):577118.

[20]BUKRINSKY M. Extracellular cyclophilins in health and di-sease[J].  Biochimica et Biophysica Acta, 2015,1850(10):2087-2095.

[21]GUO Yinan, JIANG Mei, ZHAO Xiaoting, et al. Cyclophilin a promotes non-small cell lung cancer metastasis via p38 MAPK[J].  Thoracic Cancer, 2018,9(1):120-128.

[22]SHOU Jiawei, YOU Liangkun, YAO Junlin, et al. Cyclosporine a sensitizes human non-small cell lung cancer cells to gefitinib through inhibition of STAT3[J].  Cancer Letters, 2016,379(1):124-133.

[23]ZHAO Xuemei, XIA Chengcai, WANG Xiaodan, et al. Cyclophilin J PPIase inhibitors derived from 2,3-Quinoxaline-6 amine exhibit antitumor activity[J].  Frontiers in Pharmacology, 2018,9:126.

[24]CHEN Shuai, ZHANG Mingjun, MA Honghui, et al. Oligo-microarray analysis reveals the role of cyclophilin A in drug resistance[J].  Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2008,61(3):459-469.

[25]QI Zhenyu, HUI Guozhen, LI Yao, et al. cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene[J].  Chinese Medical Journal, 2005,118(10):799-805.

[26]COUCH F J, KUCHENBAECKER K B, MICHAILIDOU K, et al. Identification of four novel susceptibility loci for oestrogen receptor negative breast cancer[J].  Nature Communications, 2016,7:11375.

[27]GALLAY P, URE D, BOBARDT M, et al. The cyclophilin inhibitor CRV431 inhibits liver HBV DNA and HBsAg in transgenic mice[J].  PLoS One, 2019,14(6):e0217433.

[28]GONG Zhaohua, MU Yuling, CHEN Jian, et al. Expression and significance of cyclophilin J in primary gastric adenocarcinoma[J].  Anticancer Research, 2017,37(8):4475-4481.

[29]HUO Dehua, YI Lina, YANG Jin′e. Interaction with Ppil3 leads to the cytoplasmic localization of apoptin in tumor cells[J].  Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008,372(1):14-18.

[30]SELMANSBERGER M, FEUCHTINGER A, ZURNADZHY L, et al. CLIP2 as radiation biomarker in papillary thyroid carcinoma[J].  Oncogene, 2015,34(30):3917-3925.

(本文編辑 黄建乡)

[收稿日期]2019-10-22; [修订日期]2020-02-12

[基金项目]中华国际医学交流基金会先声抗肿瘤治疗专项科研基金项目(Z20140615325)

[第一作者]高红红(1989-),女,硕士研究生。

[通信作者]陈剑(1973-),男,主任医师,硕士生导师。E-mail:chenjianyt@163.com。

猜你喜欢

细胞增殖肝细胞
钆塞酸二钠增强MRI肝胆期瘤周低信号与肝细胞癌术后早期复发的相关性分析
16排螺旋CT在肝细胞癌诊断中的应用分析
乙草胺对大鼠肝细胞G蛋白偶联受体介导的胞浆钙离子振荡的调控
肝细胞肝癌精准肝段切除术的疗效观察
三氧化二砷对人大细胞肺癌NCI—H460细胞凋亡影响的研究
miRAN—9对肿瘤调控机制的研究进展
人类microRNA—1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定
有关“细胞增殖”一轮复习的有效教学策略
探析介入治疗中晚期原发性肝癌破裂出血的安全性观察
RNA干扰HDACl对人乳腺癌MCF—7细胞生物活性的影响