肝细胞癌亲环素J的表达及其作用

高红红　王佳慧　王志鹏　陈剑

[摘要]目的 探讨亲环素J（CYPJ）在肝细胞癌（HCC）组织中的表达及其作用。方法 应用UALCAN和cBioPortal在线网站分析CYPJ在HCC中表达及其与临床病理特征关系，并通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测40例HCC进行验证。分析CYPJ在HCC中mRNA表达水平，并通过Kaplan-Meier生存曲线评估病人预后。将CYPJ-RNAi克隆入慢病毒载体（LV），并构建阴性对照（NC-LV），分别转染SK-Hep1细胞，qPCR方法验证转染效率。用MTT法检测不同感染复数（MOI）对SK-Hep1细胞生长的影响。结果 HCC组织中CYPJ mRNA表达高于癌旁正常组织（t=2.759，P<0.05），且与肿瘤病理分级有关（t=2.557，P<0.05）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，CYPJ mRNA高表达病人预后差（χ2=9.464，P<0.01）;通过沉默CYPJ基因表达可以抑制SK-Hep1细胞生长（t=3.231、8.976，P<0.01）。结论 CYPJ mRNA高表达在HCC生长过程中具有重要作用，并影响病人预后。

[关键词] 癌，肝细胞;亲环素J;细胞增殖;预后

[中图分类号] R730.261[文献标志码] A[文章编号] 2096-5532（2020）04-0404-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.080[HT]

[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0940.012.html;2020-04-18 16：48

EXPRESSION AND ROLE OF CYCLOPHILIN J IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA

GAO Honghong， WANG Jiahui， WANG Zhipeng， CHEN Jian

（Department of Oncology， the Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University， Yantai 264000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression and role of cyclophilin J （CYPJ） in hepatocellular carcinoma （HCC）. [WTHX]Methods UALCAN and cBioPortal online websites were used to analyze the expression of CYPJ in HCC and its association with clinicopathological features， and the results were verified by quantitative real-time PCR analysis of 40 patients with HCC. The mRNA expression of CYPJ in HCC was analyzed and the Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate patients prognosis. CYPJ-RNAi was cloned into lentivirus vector （LV） and a negative control （NC-LV） was established， and then they were transfec-ted into SK-Hep1 cells， respectively. The transfection efficiency was verified by qPCR. MTT assay was used to observe the effect of multiplicity of infection （MOI） on the growth of SK-Hep1 cells. Results The expression of CYPJ in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue （t=2.759，P<0.05）， which was associated with the pathological grade of tumor （t=2.557，P<0.05）. The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with high expression of CYPJ tended to have poor prognosis （χ2=9.464，P<0.01）. Silencing of the CYPJ gene inhibited the growth of SK-Hep1 cells （t=3.231，8.976;P<0.01）.Conclusion High expression of CYPJ plays an important role in HCC tumor growth and affects patients prognosis.

[KEY WORDS] carcinoma， hepatocellular; cyclophilin J; cell proliferation; prognosis

原發性肝癌死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第3位，其病理类型中以肝细胞型多见。在我国慢性病毒性肝炎是肝细胞癌（HCC）的主要危险因素，HCC发生是一个多步骤的过程[1]。基因测序技术揭示了许多遗传变化，包括复发突变基因和信号通路失调[2]，这些都与肝癌的发生和发展有关。但是肝癌仍然是一种致命的疾病，术后复发率高，关于其预测、诊断、治疗和预后监测仍有许多问题亟待解决[3]。亲环素家族（CYPs）在生物界广泛存在，其中亲环素A（CYPA）是发现最早、研究最深入的一个家族成员[4]。相关的研究结果已表明，CYPA 在许多恶性肿瘤组织中高表达，并与肿瘤生长、转移和耐药等密切相关[5-6]。新环素J（CYPJ）为近期研究发现的新成员，又称PPIL3，包括PPIL3a和PPIL3b 两条可变的剪切体[7]。CYPJ与CYPA序列相似度约为50%[8]，参与免疫反应、细胞增殖和凋亡等过程[9-10]。然而，关于CYPJ在HCC的生物学功能尚不清楚。本实验研究CYPJ在HCC中表达情况及其与病人临床病理特征及预后的关系，并通过沉默CYPJ基因表达抑制SK-Hep1细胞生长，为评估病人预后和开发新的靶向药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 数据来源和分析

利用UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）在线网站，通过输入“PPIL3（CYPJ）”基因名称，分析 TCGA 数据库中HCC组织（371例）和癌旁正常组织（50例）中CYPJ mRNA表达情况，及其与临床病理分级的关系。利用cBioPortal（http：//www.cbioprtal）在线网站，选择 TCGA 数据库中HCC，分析PPIL3表达情况与HCC病人预后的关系。

1.2 实验样本

HCC癌组织和癌旁正常组织样本40对，均来自烟台毓璜顶医院肿瘤科2012年3月—2013年4月收治病人，入组前未接受放疗或化疗。其中37例HCC病人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性，31例HCC病人有肝硬化。40例病人中男35例，女 5例;年龄40～71岁，平均（51.83±8.85）岁。电话随访，开始时间为病人确诊时间，结束时间为病人死亡或随访截止时间（2018年4月）。SK-Hep1细胞购自ATCC细胞库。本研究获得了病人或其家属的书面知情同意，并得到了我院伦理委员会的批准。

1.3 实验材料

RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司产品）;Trizol试剂、逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）;MTT试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.4 构建慢病毒介导的CYPJ基因沉默

携带短发夹状干扰RNA（shRNA）的慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，其正向序列为：gCTGGAAGAGGAGGCAACAG;其反向序列为：CTGTTGCCTCCTCTTCCAGc;接头序列为：TTCAAGAGA。含有3′dUdU的小干扰RNA（siRNA）片段si-CYPJ（5′-CUGGAAGAGGAGGC-AACA-3′）和si-control（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，并用Blast进行序列对比，检测结果显示构建的si-CYPJ序列与其他CYPS的mRNA没有显著的同源性，连接病毒载体进行下一步实验。

1.5 细胞培养与转染

SK-Hep1细胞用25 cm×25 cm的培養瓶培养，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，培养基为含体积分数0.01胎牛血清的RPMI-1640 5 mL。取对数生长期的SK-Hep1细胞，经消化、离心，以每孔2×105个细胞密度接种于6孔板中。随机分为实验组和对照组，待细胞生长至70%融合时按照慢病毒转染试剂盒说明书进行转染。实验组转入CYPJ表达干扰的慢病毒（CYPJ-RNAi-LV组），对照组转入空载慢病毒（NC-LV组）。转染完成后于培养箱中继续培养，为后续实验做准备。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测组织和细胞中CYPJ mRNA表达水平

取40对HCC癌组织和癌旁正常组织研磨，提取总RNA，逆转录为cDNA，加入引物进行qPCR。引物及其序列见表1。PCR的最佳条件为：95 ℃预变性5 min，扩增40周期（95 ℃、50 s，63 ℃、1 min，72 ℃、30 s），以25 μL体积（内含SYBR Premix Ex 12.5 μL，TapⅡ1 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，7.5 μL dH2O）进行PCR反应。实验重复 3 次，用2-△△Ct法计算HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA相对表达量。

细胞转染48 h后，收集CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞，提取细胞总RNA，检测各组CYPJ mRNA表达水平，实验步骤同上。实验重复3次。

1.7 MTT法检测沉默CYPJ对SK-Hep1细胞增殖的影响

取对数生长期的SK-Hep1细胞接种于96孔板，分为CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组，每组设3个复孔。将病毒上清液分别加入到各组细胞中，感染复数（MOI）设置为0、0.2、2.0、20.0和200.0，孵育96 h后，各组细胞每孔加入MTT溶液20 μL（浓度为5 g/L），置于培养箱中培养4 h，然后每孔加入Formazan溶解液100 μL，混匀并使结晶溶解，在细胞培养箱内继续孵育4 h。用酶联免疫检测仪检测各孔570 nm波长处光密度（OD）值，绘制细胞生长曲线，以细胞增殖率（ODCYPJ-RNAi-LV组/ODNC-LV组×100%）表示细胞增殖情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料结果以[AKx-D]±s形式表示，组间比较采用t检验;采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA表达水平比较

qPCR检测结果显示，40对HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA的相对表达量分别为0.894±0.422、0.668±0.303，HCC癌组织中CYPJ mRNA表达高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（t=2.759，P<0.05）。该结果与TCGA 数据库分析结果一致。见图1。

2.2 HCC癌组织CYPJ mRNA表达与临床病理特征关系

HCC癌组织中CYPJ mRNA相对表达量与病人性别、年龄、甲胎蛋白（AFP）、肿瘤大小、HBsAg、有无肝硬化和有无癌栓等无相关性（P>0.05），而与临床病理分级有关（t=2.557，P<0.05）。该结果与TCGA数据库分析结果一致。见表2。

2.3 HCC病人CYPJ mRNA表达与预后关系

以CYPJ mRNA表达水平中位数0.754为截点，将HCC病人分为低表达组和高表达组，采用Kaplan-Meier生存曲线分析显示，低表达组和高表达组生存时间分别为（53.8±10.1）、（36.1±14.2）个月;中位生存时间分别为55.3、28.9个月，5年生存率分别为55.0%、22.5%。Log-rank检验显示，低表达组病人的总生存时间（OS）较高表达组病人延长，两组比较差异有显著性（χ2=9.464，P<0.01），与cBioPortal在线网站分析结果一致。见图2。

2.4 CYPJ-RNAi-LV与NC-LV组细胞CYPJ mRNA相对表达量比较

CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞的CYPJ mRNA 相对表达量分别为0.414±0.047和0.846±0.542，两组相比较差异有显著意义（t=10.409，P<0.01）。

2.5 沉默CYPJ基因表达对SK-Hep1细胞生长的影响

MTT法检测结果显示，MOI为20.0、200.0时CYPJ-RNAi-LV组OD值明显低于NC-LV组，差异有统计学意义（t=3.231、8.976，P<0.01）。沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖。见图3。

3 讨论

HCC多起病隐匿，多数病人就诊时已属中晚期，术后复发和肝内外转移是导致HCC预后不良的主要原因，因此需要早发现和早治疗以提高治疗效果[11]。导致HCC发生的危险因素有很多，包括肝炎病毒（HBV或HCV）感染、病毒性肝炎、乙醇性肝硬化以及非乙醇性脂肪性肝炎等[12]。据统计约有80%的HCC病人是HBV携带者，这表明HBV感染在肝癌的发生、发展中具有重要作用[13]。有研究结果显示，早期HCC病人通过有效的治疗5年生存率可显著提高[14]。常用的肿瘤标志物为AFP，但其灵敏度和特异度较低[15]。随着基因组学和蛋

白质组学等技术的应用，有望获得特异性肝癌肿瘤标记物，为肝癌的早期发现提供依据[16]。CYPs家族具有肽基脯氨酰基顺反式异构酶（PPlase）活性和分子伴侣功能，在多种疾病中发挥重要作用[17]。其中，CYPA参与病毒感染[18]、炎性疾病[19]和肿瘤形成[6]等病理过程。CYPA与环孢素A（Cs A）具有高度親合力[17]，二者在细胞内相互作用可以形成CYPA-Cs A复合物，该复合物可以阻断丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）/p38信号通路的活化，从而抑制细胞的增殖[20]。另有研究发现，CYPA在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达，可以促进细胞增殖、侵袭和迁移，p38抑制剂SB 203580可以抑制细胞的迁移[21]。在治疗晚期NSCLC病人时发现，Cs A与吉非替尼组合比单独应用吉非替尼更有效[22]。ZHAO等[23]研究发现，含喹喔啉的ZX-J-19及其衍生物ZX-J-19j和ZX-J-19l可抑制PPIase活性，对肿瘤细胞生长有显著的抑制作用，且效果比Cs A好。还有研究发现，HCC病人CYPA高表达与耐药相关基因的表达及化疗耐药产生有关[24]。这些研究表明，CYPA在肿瘤发生、发展中具有重要作用，并与耐药产生有关，而亲环素抑制剂在治疗肿瘤方面具有重要的意义。由于CYPA和CYPJ序列相似度高，可能在某些功能上极为相似，CYPJ在肿瘤发生发展中的作用值得探讨。

在2005年，已有研究者通过基因芯片技术将CYPJ作为差异性基因，从脑胶质瘤组织中筛选出来[25]。另有研究通过对11项全基因组相关研究进行分析发现，CYPJ（2q33）可作为乳癌的风险基因，该研究结果有助于提高乳癌家族发病风险的预测[26]。PHILIPPE等[27]的研究结果显示，亲环素抑制剂（CRV431）可以抑制亲环素PPlase的活性，从而抑制小鼠肝脏内的HBV DNA水平。HBV感染是HCC最常见的危险因素，这一研究结果为HCC治疗带来了启示。GONG等[28]应用免疫组化实验对120例胃癌组织和癌旁组织研究发现，CYPJ在胃癌组织中高表达，且与肿瘤分化程度有关，在肿瘤生长过程中具有重要作用。本研究通过UALCAN在线网站分析显示CYPJ在HCC中高表达，与临床病理分级有关，并通过qPCR实验进一步验证了数据库分析的结果。有研究结果表明，在癌细胞中CYPJ与凋亡蛋白相互作用，影响其发挥作用，为研究凋亡蛋白在细胞中的定位机制提供了新的方向[29]。SELMANSBERGER等[30]在对核辐射后甲状腺癌研究时发现，CLIP2参与细胞凋亡、MAPK信号传导和遗传不稳定性等致癌过程，且影响CYPJ的表达水平。本文研究结果显示，通过沉默CYPJ基因的表达可以抑制SK-Hep1细胞的生长，证明了CYPJ可以促进癌细胞增殖，其具体作用机制有待下一步实验。本研究结果还显示，CYPJ基因高表达HCC病人预后差，结果与cBioPortal在线网站分析结果一致。其次，本文结果还显示，沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖，并选择高效率MOI为后续实验做准备;CYPJ在肿瘤生长过程中具有重要作用，并影响病人预后。目前关于CYPJ在肝癌中作用研究较少，值得进一步研究。

总之，CYPJ基因在HCC癌组织中表达升高，并影响病人预后。沉默CYPJ基因表达可以抑制细胞增殖，其作用机制可能与MAPK/p38信号通路有关，有待下一步研究证实。CYPJ可能成为评估病人预后、开发新型抗癌药物的潜在靶点。

[参考文献]

[1]ISLAMI F， CHEN W， YU X Q， et al. Cancer deaths and cases attributable to lifestyle factors and infections in China， 2013[J].  Annals of Oncology， 2017，28（10）：2567-2574.

[2]NIU Zhaoshan， NIU Xiaojun， WANG Wenhong. Genetic alterations in hepatocellular carcinoma： an update[J].  World Journal of Gastroenterology， 2016，22（41）：9069-9095.

[3]WEN T F， JIN C， FACCIORUSSO A， et al. Multidisciplinary management of recurrent and metastatic hepatocellular carcinoma after resection：an international expert consensus[J].  Hepatobiliary Surgery and Nutrition， 2018，7（5）：353-371.

[4]FENG Wenhua， XIN Yan， XIAO Yuping， et al. Cyclophilin a enhances cell proliferation and xenografted tumor growth of early gastric cancer[J].  Digestive Diseases and Sciences， 2015，60（9）：2700-2711.

[5]QIAN Zhe， ZHAO Xiaoting， JIANG Mei， et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9[J].  BMC Cancer， 2012，12：442.

[6]NIGRO P， POMPILIO G， CAPOGROSSI M C. Cyclophilin A： a key player for human disease[J].  Cell Death & Disease， 2013，4（10）：e888.

[7]ZHOU Z， YING K， DAI J， et al. Molecular cloning and cha-racterization of a novel peptidylprolyl isomerase （cyclophilin）-like gene （PPIL3） from human fetal brain[J].  Cytogenetics and Cell Genetics， 2001，92（3/4）：231-236.

[8]HUANG Lili， ZHAO Xuemei， HUANG Chaoqun， et al. Structure of recombinant human cyclophilin J， a novel member of the cyclophilin family[J].  Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography， 2005，61（Pt 3）：316-321.

[9]SHENG Chunjie， YAO Chen， WANG Ziyang， et al. Cyclophilin J limits inflammation through the blockage of ubiquitin chain sensing[J].  Nature Communications， 2018，9（1）：4381.

[10]CHEN J， LIEFKE R， JIANG L X， et al. Biochemical features of recombinant human cyclophilin J[J].  Anticancer Research， 2016，36（3）：1175-1180.

[11]CHEN W Q， ZHENG R S， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J].  CA-A Cancer Journal for Clinicians， 2016，66（2）：115-132.

[12]HLADY R A， ROBERTSON K D. Genetic and epigenetic he-terogeneity in normal liver homeostasis and its implications for liver disease and hepatocellular cancer[J].  Seminars in Liver Disease， 2018，38（1）：41-50.

[13]LI Zhiqin， WANG Hongyan， ZENG Qinglei， et al. p65/miR-23a/CCL22 axis regulated regulatory T cells recruitment in hepatitis B virus positive hepatocellular carcinoma[J].  Cancer Medicine， 2020，9（2）：711-723.

[14]VILANA R， FORNER A， GARCA A， et al. Hepatocellular carcinoma： diagnosis， staging， and treatment strategy[J].  Radiologia， 2010，52（5）：385-398.

[15]WANG Ting， ZHANG Kunhe， HU Piaoping， et al. Combination of dual serum fluorescence， AFP and hepatic function tests is valuable to identify HCC in AFP-elevated liver diseases[J].  Oncotarget， 2017，8（58）：97758-97768.

[16]LI Bo， LI Boan， GUO Tongsheng， et al. The clinical values of serum markers in the early prediction of hepatocellular carcinoma[J].  BioMed Research International， 2017， 2017：5358615.

[17]DAVIS T L， WALKER J R， CAMPAGNA-SLATER V， et al. Structural and biochemical characterization of the human cyclophilin family of peptidyl-prolyl isomerases[J].  PLoS Bio-logy， 2010，8（7）：e1000439.

[18]KIM K， DAUPHIN A， KOMURLU S， et al. Cyclophilin a protects HIV-1 from restriction by human TRIM5α[J].  Nature Microbiology， 2019，4（12）：2044-2051.

[19]GARIMELLA V， MCVOY J S， OH Unsong. The contribution of cyclophilin A to immune-mediated central nervous system inflammation[J].  Journal of Neuroimmunology， 2020，339（339）：577118.

[20]BUKRINSKY M. Extracellular cyclophilins in health and di-sease[J].  Biochimica et Biophysica Acta， 2015，1850（10）：2087-2095.

[21]GUO Yinan， JIANG Mei， ZHAO Xiaoting， et al. Cyclophilin a promotes non-small cell lung cancer metastasis via p38 MAPK[J].  Thoracic Cancer， 2018，9（1）：120-128.

[22]SHOU Jiawei， YOU Liangkun， YAO Junlin， et al. Cyclosporine a sensitizes human non-small cell lung cancer cells to gefitinib through inhibition of STAT3[J].  Cancer Letters， 2016，379（1）：124-133.

[23]ZHAO Xuemei， XIA Chengcai， WANG Xiaodan， et al. Cyclophilin J PPIase inhibitors derived from 2，3-Quinoxaline-6 amine exhibit antitumor activity[J].  Frontiers in Pharmacology， 2018，9：126.

[24]CHEN Shuai， ZHANG Mingjun， MA Honghui， et al. Oligo-microarray analysis reveals the role of cyclophilin A in drug resistance[J].  Cancer Chemotherapy and Pharmacology， 2008，61（3）：459-469.

[25]QI Zhenyu， HUI Guozhen， LI Yao， et al. cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene[J].  Chinese Medical Journal， 2005，118（10）：799-805.

[26]COUCH F J， KUCHENBAECKER K B， MICHAILIDOU K， et al. Identification of four novel susceptibility loci for oestrogen receptor negative breast cancer[J].  Nature Communications， 2016，7：11375.

[27]GALLAY P， URE D， BOBARDT M， et al. The cyclophilin inhibitor CRV431 inhibits liver HBV DNA and HBsAg in transgenic mice[J].  PLoS One， 2019，14（6）：e0217433.

[28]GONG Zhaohua， MU Yuling， CHEN Jian， et al. Expression and significance of cyclophilin J in primary gastric adenocarcinoma[J].  Anticancer Research， 2017，37（8）：4475-4481.

[29]HUO Dehua， YI Lina， YANG Jin′e. Interaction with Ppil3 leads to the cytoplasmic localization of apoptin in tumor cells[J].  Biochemical and Biophysical Research Communications， 2008，372（1）：14-18.

[30]SELMANSBERGER M， FEUCHTINGER A， ZURNADZHY L， et al. CLIP2 as radiation biomarker in papillary thyroid carcinoma[J].  Oncogene， 2015，34（30）：3917-3925.

（本文編辑 黄建乡）

[收稿日期]2019-10-22; [修订日期]2020-02-12

[基金项目]中华国际医学交流基金会先声抗肿瘤治疗专项科研基金项目（Z20140615325）

[第一作者]高红红（1989-），女，硕士研究生。

[通信作者]陈剑（1973-），男，主任医师，硕士生导师。E-mail：chenjianyt@163.com。