活动性肺结核患者外周血髓样树突状细胞中BTLA与B7-H4共表达检测及临床意义

徐 欢 黄 纪 孙胤富 王万党 张俊爱 徐军发

活动性肺结核是结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，目前其发病机制尚不明确，但细胞免疫在介导其发生、发展中发挥重要作用。笔者前期工作中发现，结核性胸膜炎患者外周血及胸水中树突状细胞及其亚群髓样性DC比例显著高于正常对照组，且与IL-12水平呈正相关。BTLA与B7-H4是近年来发现的免疫检查点抑制因子(immune checkpoint inhibitors)，表达在T细胞上的BTLA通过HVEM-BTLA信号途径抑制T细胞的增殖、分化和多种细胞因子的分泌[1]。笔者前期研究中发现BTLA和B7-H4在肺结核患者外周血CD11c+抗原递呈细胞中高表达，且表达BTLA和B7-H4的CD11c+APC活化同种T细胞的能力下降，提示BTLA和B7-H4对抗原递呈细胞抗结核免疫有重要影响[2]。而mDC是CD11c+抗原递呈细胞中最主要的细胞之一[3]。在体内能活化初始T细胞的抗原递呈，在固有性和适应性结核免疫中发挥重要作用[4]。在活动性肺结核患者中，检查点抑制分子BTLA和B7-H4对mDC的抗结核免疫的影响尚不清楚，本研究采用流式细胞技术对46例诊断为活动性肺结核的患者外周血mDC中BTLA及B7-H4共表达情况进行了检测，分析其与mDC表面成熟标志分子CD83、抗原递呈分子HLA-DR以及共刺激分子CD86表达的相关性，探究其临床意义。

资料与方法

1.研究对象:46例活动性肺结核患者及23例健康对照均来自广东医科大学附属厚街医院。排除标准：①妊娠;②酗酒;③年龄<16岁或>65岁;④HIV阳性;⑤其他传染病和慢性疾病(如糖尿病);⑥近1个月内服用激素等治疗的患者。根据抗结核药物治疗情况，本研究中将活动性肺结核患者分为抗MTB药物治疗前(prior treatment，PRT)组和治疗后(post treatment，POT)组，其中，治疗<3天者为治疗前，治疗2周者为治疗后。本研究经过广东医科大学附属厚街医院和广东医科大学医学伦理学委员会批准，已征得研究对象的知情同意。

2.主要试剂和仪器:流式抗体分别为Lin1-FITC(为混合抗体，包括FITC标记的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56的抗体，克隆号是SK7、3G8、SJ25C1、L27、eMfP9、NCAM16.2)购自美国BD公司；BTLA-APC(MIH26，Biolegend)，B7-H4-P (H74，eBioscience)，CD83- PerCP-CyTM5.5(HB15，Biolegend)，CD11c- APC-eFluor780(BU15，eBioscience)，HLA-DR- PE-Cyanine7(LN3，eBioscience)，以及各自同型抗体均购自美国eBioscience公司。人淋巴细胞分离液购自美国GE公司，FACS-CantoⅡ流式细胞仪型号为美国BD公司产品。

3.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的分离：具体方法参考文献[5]，肝素钠抗凝血5ml离心1500r/min,5min，上清血浆与-80℃冻存；血液细胞与无菌0.9%氯化钠溶液1∶1混合稀释，将稀释液缓慢加入淋巴细胞分离液上，室温870×g离心30min，分离单个核细胞。

4.流式细胞术检测mDC共表达BTLA和B7-H4以及BTLA、B7-H4双阳性mDC和 BTLA、B7-H4双阴性mDC表达CD83、HLA-DR和CD86:取100μl含1×106个PBMC于流式管中，加入推荐量荧光团标记的抗体(CD83-PerCP-CyTM5.5、HLA-DR- PE-Cyanine7、CD11c- APC-eFluor780、Lin1-FITC、BTLA-APC、B7-H4-PE、CD86-FITC)，以相同的方式各加入各自相应同型抗体作为对照。振荡混匀，4℃避光孵育30min；加入2ml洗涤液洗2次，弃上清；加入200μl 10g/L多聚甲醛溶液，轻轻混匀，4℃避光保存。24h内上机检测分析，采用FlowJo 7.6.1软件进行数据分析。

结 果

1.BTLA和B7-H4在活动性肺结核患者外周血中高表达:采用流式细胞技术检测APT患者外周血来源mDC中BTLA和B7-H4共表达情况。结果显示患者外周血mDC中BTLA和B7-H4共表达水平显著高于健康对照组(图1A，P=0.000)，AUR=0.9282(图1B)。

图1 BTLA和B7-H4在活动性肺结核患者(APT)外周血mDC中高表达

2.BTLA和B7-H4在治疗前后、初治与复治患者中DP-mDC表达情况：10例患者经1个月治疗后DP-mDC比例显著下降(图2A，P<0.01)。复治患者中表达显著高于初治患者(图2B，P<0.05)。

图2 治疗前后、初治与复治患者中DP-mDC表达情况

3.BTLA和B7-H4共表达mDC中CD83的表达:健康对照组和APT外周血共表达BTLA和B7-H4的mDC中表达CD83的阳性率均显著高于不表达BTLA和B7-H4的mDC(图3中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表达和不表达BTLA和B7-H4的mDC中CD83的表达高于健康对照组(图3C，P<0.05)。

4.BTLA和B7-H4共表达mDC中HLA-DR表达:健康对照组和患者组外周血共表达BTLA和B7-H4的mDC中表达HLA-DR的阳性率均显著高于不表达BTLA和B7-H4的mDC(图4中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表达BTLA和B7-H4的mDC和不表达BTLA和B7-H4的mDC中HLA-DR的表达均显著低于健康对照组(图4C，P=0.000)。

图3 DP-mDC、DN-mDC中CD83的表达

图4 DP-mDC、DN-mDC中HLA-DR的表达

5.BTLA和B7-H4共表达mDC中CD86表达：健康对照组和患者组外周血共表达BTLA和B7-H4的mDC中表达CD86的水平显著低于不表达BTLA和B7-H4的mDC(图5中A、B，P<0.01)。但患者外周血中共表达和不表达BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表达均显著高于健康对照组(图5C，P=0.000)。

图5 DP-mDC、DN-mDC中CD86的表达

讨 论

笔者的研究结果发现共表达BTLA和B7-H4的mDC在TP患者外周血中显著高于健康对照组; APT外周血中DP-mDC的表达显著高于健康对照组，复治患者中比例显著高于初治患者，经过1个月治疗DP-mDC比例显著降低。进一步研究发现，在健康对照和患者外周血中，DP-mDC表达CD83和HLA-DR都显著高于DN-mDC,而CD86在DP-mDC中的表达水平低于DN-mDC。APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表达CD86和CD83水平都显著高于健康对照组，但APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表达HLA-DR的水平显著低于健康对照组。以上结果提示BTLA和B7-H4在活动性肺结核中可能影响mDC的抗结核免疫。

树突状细胞(DC)在抗结核中发挥着重要作用，APT患者mDC上高表达BTLA和B7-H4可能介导结核杆菌的免疫逃逸，BTLA主要表达在T细胞和一些髓原性细胞上，表达在T细胞上的BTLA可与配体HVEM作用来抑制T细胞增殖与活化，并抑制T细胞分泌多种细胞因子[1]。在活动性肺结核患者CD4+和CD8+T细胞高表达BTLA，BTLA通过抑制T细胞的活性参与结核病的进展[6]。在免疫性疾病系统性红斑狼疮患者中Th1、Th2和Th17效应T细胞上的BTLA表达与活动性疾病相关,BTLA作为共抑制分子在系统性红斑狼疮患者T细胞稳态和疾病活动中发挥重要作用[7]。肝细胞癌中BTLA抑制T细胞功能参与其免疫进程，免疫抑制分子BTLA有望成为新的肿瘤免疫治疗靶点[8]。笔者前期研究发现，APT外周血CD11c+抗原递呈细胞高表达BTLA，且BTLA的表达与CD11c+抗原递呈细胞活化同种T细胞功能下降相关[2]。目前笔者的结果显示DP-mDC在APT外周血中的表达显著高于健康对照组，复治患者中比例显著高于初治患者，经过1个月治疗DP-mDC比例显著降低。提示在ATP中，结核杆菌可能通过升高BTLA来抑制mDC的功能，并且通过mDC高表达B7-H4来抑制T细胞的免疫活性，最终影响机体的抗结核免疫。经治疗后BTLA和B7-H4表达水平降低，BTLA对mDC的抑制作用也随之降低, mDC通过B7-H4对T细胞的抑制作用也降低。

CD83分子是成熟DC细胞表面重要的标志分子，参与DC细胞功能的调节。用结核菌体或菌体抗原体外刺激可诱导其成熟并且高表达CD83[9,10]。笔者前期研究发现，在结核性胸膜炎患者中mDC活化成熟，高表达CCR7和CD83[11]。BTLA不仅在T细胞的表面高表达，在成熟的DC细胞上也有表达。BTLA在T细胞上的表达可抑制其增殖活化和多种细胞因子的分泌。成熟DC细胞在高表达CD83的同时也高表达免疫负向调节因子，包括BTLA和B7-H4[12]，其在DC 细胞上的表达可能对其功能有影响。Kobayashi等[13]研究发现BTLA可抑制LPS刺激时DC和巨噬细胞的功能，BTLA-/-小鼠极易发生LPS诱导的内毒素休克。有研究发现腺病毒介导的CCR7和BTLA过表达可增强未成熟树突状细胞的免疫耐受性和迁移[14]。笔者研究发现，无论是APT还是健康对照组其外周血DP mDC 表达CD83的比例都显著高于DN mDC，这些结果显示APT外周血中DP mDC相对成熟，提示检查点共抑制分子BTLA和B7-H4可能倾向于表达在成熟的mDC上，表达在成熟mDC上的共抑制分子一方面可抑制其进一步的活化，最终抑制CD83的升高；另一方面可抑制T细胞的活化，大道维持mDC的免疫自稳，目前，笔者也进一步发现ATP患者DP mDC和DN mDC表达CD83都显著高于健康对照，提示ATP患者中的DC是相对成熟活化的，在机体的抗结核免疫中具有重要的作用。而BTLA和B7-H4在ATP患者mDC中高表达也进一步地说明它们可能具有抑制mDC的免疫活性的特点。

抗原递呈分子HLA-DR可递呈抗原给T细胞，刺激T细胞的活化。成熟的DC也高表达HLA-DR。笔者的研究发现无论是APT还是健康对照组其外周血DP mDC表达HLA-DR的水平都显著高于DN mDC，这同样说明了DP mDC是相对成熟的DC，这提示检查点共抑制分子BTLA和B7-H4倾向于在成熟活化的mDC上表达，其可能作用是对mDC免疫活性产生抑制，维持其免疫自稳。笔者的结果发现在APT外周血中DP mDC 表达HLA-DR显著低于健康对照组，可能原因是患者外周血mDC高表达BTLA和B7-H4，高表达的BTLA和B7-H4可能抑制了mDC的免疫活性。结核菌或卡介苗感染抗原递呈细胞后，HLA-DR的表达受到抑制[15]。结核菌感染小鼠模型中DC表达MHC-2也是降低的。这可能与结核菌感染导致mDC高表达BTLA有关，过高表达的BTLA可能抑制了DC表达HLA-DR。这可能是结核病患者DC免疫功能低下的一个原因。另一方面则通过增加B7-H4表达抑制HLA-DR对T细胞的激活作用。

CD86是在抗原递呈细胞上表达的分子，在T细胞的增殖分化中发挥重要作用。笔者的研究发现正常对照组和患者组外周血共表达BTLA和B7-H4的mDC中表达CD86的水平显著低于不表达BTLA和B7-H4的mDC，但患者外周血中共表达BTLA和B7-H4的mDC和不表达BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表达均显著高于健康对照组。有研究表明，结核菌感染后DC较高表达CD80和CD86[16]。笔者最近研究发现，在APT中表达BTLA的CD11c+抗原递呈细胞CD86表达增加[2]。APT患者CD86表达的增高一方面可激活免疫系统，增强T细胞介导的杀菌作用；另一方面可能是对APT患者中DC功能降低进行补偿，达到抗结核作用。

综上所述，本研究结果显示APT外周血mDC高表达BTLA和B7H4比例显著升高，进行有效的抗结核治疗后，mDC共表达BTLA和B7-H4的比例明显降低；高表达BTLA和B7-H4影响mDC的成熟以及HLA-DR的表达，提示在APT中BTLA和B7-H4可负向调节mDC的免疫活性，有可能是结核菌的免疫逃逸机制。BTLA和B7H4调节DC成熟的机制尚不清楚，共表达BTLA和B7-H4的mDC的免疫功能还有待于进一步阐明。