基于超高效液相色谱-高分辨质谱法的油料作物脂质组学分析

赵新楠，王秀嫔*，李培武，印南日，万立昊，5，王 晓，张良晓

(1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430062；2.农业农村部油料作物生物学与遗传改良重点实验室，湖北 武汉 430062；3.农业农村部油料作物风险评估重点实验室，湖北 武汉 430062;4.农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北 武汉 430062；5.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001)

人体膳食对植物性油脂的摄入主要来自油料作物，其主要成分为脂质。国际脂质分类和命名委员会将脂质分为8类：脂肪酸类(FA)、甘油酯类(GL)、甘油磷脂类(GP)、鞘脂类(SP)、糖脂类(SL)、聚酮化合物(PK)、甾醇类(SP)和异戊烯醇类(PR)[1]。油料作物的主要成分甘油三酯(Triglyceride,TG)是脂肪传递介质，也是人体重要的储能物质[2-3]。除甘油三酯外，油料作物中的其他脂质成分对生命体也有重要意义。例如磷脂具有较高的营养价值，是构成细胞膜的主要成分，对细胞膜结构、功能及信号传导有重要作用，此外还能够促进神经传导，改善记忆力，研究证明癌症的发生也与磷脂有关[4-6]。磷脂在形成抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗炎以及降低心血管疾病和胆固醇水平等方面发挥着关键作用，从食物中摄取的磷脂对人体健康十分重要[7-8]。然而，由于脂质种类众多，结构复杂，对其准确定性定量仍是目前的科学难题。

目前对于油脂脂质的分析主要集中于植物油，尤其是关于磷脂的研究主要聚焦于毛油和油脚的分析，关于油料作物本身的脂质组成研究较少，在一定程度上影响了油料作物脂质成分的合理应用。张东等[9-10]利用高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(HPLC-TOF-MS)分析了椰子油及大豆油中的部分甘油三酯成分；Verardo等[11]使用HPLC-TOF-MS分析了初榨橄榄油中的部分甘油磷脂成分；赵琦琰等[12]利用直接进样高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)测定了花生中的磷脂成分。上述研究结果仅针对脂质中某类成分进行分析，不能从全局角度完整分析油料中的脂质。

脂质组学是通过表征和定量对脂质分子种类及其生物学功能进行全面描述的新研究方向[13-15]。将脂质组学的方法运用于油料作物全脂质分析，可为油料作物脂质分析提供新途径。Orbitrap Fusion质谱仪是四极杆、线性离子阱、傅立叶变换离子回旋共振杂合质谱，具有高分辨率、高灵敏度以及高质量精度的特点，可在一次扫描中生成大量质谱信息，在短时间内获得未知物的多级质谱碎片以及大量脂质信息，从而更好地实现复杂脂质的检测、分离和鉴定。利用精确分子质量，Orbitrap Fusion 质谱仪可确定出脂质成分的唯一分子式，结合保留时间和二级质谱可实现对脂质结构中脂肪酸链的鉴别，从而实现脂质的唯一定性。本研究利用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-Orbitrap Fusion MS)技术实现了油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米5种油料作物中脂质分子的精准定性，识别出132种脂质分子，并使用峰面积比进行了相对含量的比较。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙腈、异丙醇(色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；氯仿(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(纯度>98%)、甲酸铵(纯度>99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

DTC-27J超声波水浴锅(湖北鼎泰生化技术设备制造有限公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；XH-C旋涡混匀器(常州未来仪器制造有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Hitachi CT6E离心机(日本日立有限公司)；BF-2000型氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)。

Dionex 高效液相色谱系统串联Thermo Orbitrap Fusion质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm，美国Waters公司)。脂质分析软件lipidsearch 4.0(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取样品脂质提取参考Bligh和Folch等的方法[16-17]，准确称取0.5 g油料(油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米)粉末样品于10 mL具塞离心管中，加入6.0 mL氯仿-甲醇(2∶1，体积比)混合溶液，旋涡混匀；30 ℃超声波提取30 min后，以3 500 r/min离心10 min，取全部上清液。上清液中加入1.0 mL超纯水，旋涡混匀后，3 500 r/min离心10 min，取下层液体用500 μL氮气吹干，用1.0 mL 氯仿-甲醇(1∶2)混合溶液复溶，过0.22 μm有机相滤膜后保存于进样瓶中，待超高效液相色谱-高分辨质谱分析。

1.2.2 超高效液相色谱-高分辨质谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流动相：A为乙腈-水(6∶4，体积比)混合溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵)，B为异丙醇-乙腈(9∶1，体积比)混合溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵)。流动相梯度在文献方法[18]的基础上，进一步优化缩短分析时间，洗脱梯度如下：0～0.5 min，20% B；0.5～1.5 min，20%～40% B；1.5～3 min，40%～70% B；3～13 min，70%～98% B；13～13.1 min，98%～20% B;13.1～17 min，20% B。流速为0.2 mL/min；进样量为1 μL；柱温为40 ℃。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源(ESI)，采用Data Dependent MS2扫描模式采集数据。离子源参数如下：喷雾电压：3 500(+)V/3 000(-)V，毛细管温度：320 ℃，雾化温度：320 ℃，辅助气流速：6.05 L/min，鞘气流速：8.4 L/min，碰撞气流速：0 L/min；一级质谱条件：全扫描范围为150～1 200m/z；Orbitrap分辨率：240 000；自动增益控制(AGC)：1.0e6；最大注入时间：100 ms。二级质谱条件：碎裂方式为高能诱导裂解(HCD);HCD碰撞能量：(35±5) eV；Orbitrap分辨率：30 000；AGC：5.0e4；最大注入时间：60 ms。

1.2.3 定性、定量及统计分析脂质分子的碎片信息如表1所示，在正离子模式下甘油酯通过产生的母离子[M+NH4]+以及二级质谱碎片(脂肪酸相关碎片)与数据库结合进行定性分析，甘油磷脂和溶血甘油磷脂则通过负离子模式下产生的母离子[M+HCOO]-、[M-H]-以及二级质谱碎片(脂肪酸碎片和特征碎片)与数据库结合进行定性，同时结合脂质分析软件lipidsearch 4.0进行分析。利用峰面积进行相对定量，峰面积计算使用软件Xcalibur(Version 2.0.7;Thermo Fisher Scientific)建立方法，图表绘制使用Microsoft excel以及MetaboAnalyst完成。

表1 各类脂质在正、负离子模式下的碎片信息Table 1 Fragment informations of lipids in positive and negative ion modes

*R,R1and R2all refer to fatty acid chains(R、R1、R2均指脂肪酸链)

2 结果与讨论

分别采用正、负离子模式采集数据，发现在“1.2.2”洗脱梯度下，脂质成分约从5 min开始逐渐被洗脱下来，主要集中于5～15 min出峰，部分保留时间相近的峰不易分开，但可通过将谱图放大后，选择目标离子的二级质谱进行鉴定,并结合软件lipidsearch 4.0的识别结果进行筛选，设置母离子和二级离子的质量精确度匹配阈值与提峰质量精确度阈值均为5 ppm。

2.1 油料作物中脂质成分的定性分析

经过分析从5种油料作物中获得132种主要脂质成分，包括8种甘油二酯(DG)、5种LPC、2种LPE、24种PC、18种PE、8种PI、1种PS、1种PG以及65种TG，所有脂质的母离子和二级碎片离子如表2所示。

表2 脂质成分的母离子及二级碎片离子Table 2 Parent ions and secondary fragment ions of lipids compositions

(续表2)

NumberLipid specieParent ionMS(m/z)MS2(m/z)56PE(18∶2/22∶0)[M-H]-798.599 3279.232 2,339.325 9,140.011 357PE(18∶3/18∶3)[M-H]-734.474 8277.216 6,140.011 458PG(16∶0/18∶2)[M-H]-745.500 2279.232 2,255.232 3,171.005 859PI(16∶0/18∶1)[M-H]-835.531 1281.247 9,255.232 3,241.011 260PI(16∶0/18∶2)[M-H]-833.516 1279.232 3,255.232 4,241.011 361PI(16∶0/18∶3)[M-H]-831.500 7255.232 3,277.216 6,241.011 262PI(18∶0/18∶1)[M-H]-863.562 7283.263 5,281.247 9,241.011 263PI(18∶1/18∶1)[M-H]-861.547 0281.247 8,241.011 164PI(18∶1/18∶2)[M-H]-859.530 9281.247 9,279.232 3,241.011 265PI(18∶2/18∶2)[M-H]-857.515 6279.232 2,241.011 266PI(18∶2/18∶3)[M-H]-855.500 4279.232 1,277.216 6,241.011 267PS(18∶2/22∶0)[M-H]-842.589 1339.325 9,279.232 3,755.559 668TG(14∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+822.757 1549.489 1,577.520 3,523.473 1,239.237 6,265.235 0,339.290 369TG(15∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+836.772 9563.504 3,537.489 0,577.520 3,225.221 9,239.273 4,265.252 970TG(15∶0/16∶0/18∶2)[M+NH4]+834.757 6561.488 9,537.488 9,575.504 6,225.221 9,239.273 4,263.237 671TG(15∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+862.788 9563.504 4,603.535 9,225.221 8,265.253 172TG(15∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+860.773 3601.520 5,561.489 1,563.504 6,225.221 9,263.237 6,265.253 173TG(15∶0/18∶2/18∶2)[M+NH4]+858.758 1561.488 9,599.504 8,225.221 9,263.237 674TG(15∶1/16∶0/18∶2)[M+NH4]+832.741 9575.504 9,559.473 7,535.473 7,223.206 1,239.273 4,263.237 675TG(15∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+856.742 2599.504 8,559.473 4,223.206 1,263.237 676TG(16∶0/16∶0/16∶0)[M+NH4]+824.773 7551.504 5,239.237 477TG(16∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+850.789 4577.520 3,551.504 9,239.237 4,265.253 278TG(16∶0/16∶0/18∶2)[M+NH4]+848.772 9575.504 7,551.504 8,263.237 5,239.237 479TG(16∶0/16∶1/18∶2)[M+NH4]+846.757 3573.489 2,575.504 9,549.485 180TG(16∶0/18∶1/18∶0)[M+NH4]+878.820 5605.551 5,577.520 4,579.535 6,265.253 1,239.237 3,267.268 981TG(16∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+876.804 3577.520 5,603.536 2,265.253 2,239.237 482TG(16∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+874.788 9577.520 4,575.504 9,601.520 5,263.237 5,265.253 1,239.237 483TG(16∶0/18∶1/19∶1)[M+NH4]+890.784 0577.520 1,591.498 9,617.526 2,239.237 2,265.253 0,279.232 384TG(16∶0/18∶1/20∶0)[M+NH4]+906.851 8577.520 5,607.567 6,633.583 0,239.237 6,265.235 1,295.299 985TG(16∶0/18∶1/20∶1)[M+NH4]+948.898 6577.520 3,649.614 5,675.630 0,239.273 4,265.253 1,337.347 586TG(16∶0/18∶1/21∶0)[M+NH4]+920.866 9577.520 4,621.583 2,647.598 7,239.237 4,265.253 1,309.315 087TG(16∶0/18∶1/22∶0)[M+NH4]+934.882 9635.598 5,577.520 4,661.614 6,265.253 1,323.332 1,239.237 488TG(16∶0/18∶1/24∶0)[M+NH4]+962.914 4577.519 9,663.630 2,689.646 2,239.237 0,265.253 389TG(16∶0/18∶2/18∶2)[M+NH4]+872.773 5575.504 6,599.504 8,263.237 4,239.237 390TG(16∶0/18∶2/18∶3)[M+NH4]+870.758 2573.489 2,575.504 9,597.489 6,261.221 5,263.237 5,239.237 291TG(16∶0/18∶2/19∶0)[M+NH4]+890.783 8575.504 8,593.515 4,617.575 0,239.237 2,263.237 4,281.247 392TG(16∶0/18∶2/19∶1)[M+NH4]+888.768 9575.504 9,591.499 6,615.499 6,239.237 5,263.237 5,279.232 593TG(16∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+870.758 2573.489 3,599.505 1,237.221 9,263.237 694TG(16∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+868.743 2571.473 5,599.504 9,235.206 1,263.237 595TG(17∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+888.804 3601.520 3,589.520 9,591.536 5,263.236 5,265.254 096TG(17∶1/18∶1/18∶2)[M+NH4]+886.788 3589.520 9,587.504 8,601.520 497TG(17∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+884.773 9587.504 9,599.504 9,263.237 5,251.237 598TG(17∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+882.758 2585.489 3,599.505 0,263.237 5,249.221 799TG(18∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+904.835 6605.551 5,603.536 2,265.253 1,339.289 7100TG(18∶1/18∶1/18∶1)[M+NH4]+902.819 5603.536 3,265.253 2,339.290 0101TG(18∶1/18∶1/18∶2)[M+NH4]+900.804 0601.520 5,603.536 1,265.253 1,263.237 6,339.289 9,337.274 7102TG(18∶1/18∶1/19∶1)[M+NH4]+916.799 3617.515 3,603.536 1,279.236 5,265.253 1103TG(18∶1/18∶1/20∶0)[M+NH4]+932.867 0633.582 2,603.534 1,265.253 0,339.219 9104TG(18∶1/18∶1/20∶1)[M+NH4]+930.851 0631.567 5,603.536 3,265.237 5,293.284 5105TG(18∶1/18∶1/21∶0)[M+NH4]+946.882 3603.536 1,647.598 6,265.253 1,309.316 5106TG(18∶1/18∶1/22∶0)[M+NH4]+960.898 8661.614 6,603.536 1,265.253 1,323.331 1,339.289 9,397.368 3107TG(18∶1/18∶1/23∶0)[M+NH4]+974.913 9675.630 1,603.536 1,265.253 1,337.347 1108TG(18∶1/18∶1/24∶0)[M+NH4]+988.930 5689.646 1,603.536 3,265.253 2,351.362 9109TG(18∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+898.788 8601.520 3,599.504 9,263.237 5,265.253 1,337.274 2,339.290 0110TG(18∶1/18∶2/20∶0)[M+NH4]+930.851 4631.567 4,633.582 6,601.520 4,263.237 5,265.253 1,295.300 3111TG(18∶1/18∶2/20∶1)[M+NH4]+928.835 0601.520 9,629.552 2,631.567 8,265.253 3,263.237 6,293.284 7112TG(18∶1/18∶2/21∶0)[M+NH4]+944.866 3601.520 6,645.583 4,647.598 8,263.237 5,265.253 1,309.316 5113TG(18∶1/18∶2/22∶0)[M+NH4]+958.882 4659.598 9,661.613 2,601.519 9,265.253 3,263.237 3,323.330 9114TG(18∶1/18∶2/23∶0)[M+NH4]+972.897 8675.630 1,673.614 6,601.520 4,265.253 0,263.375 0,337.274 6115TG(18∶1/18∶2/24∶0)[M+NH4]+986.913 7601.520 6,689.646 2,687.630 4,265.253 1,263.237 5,351.362 9116TG(18∶1/18∶2/24∶1)[M+NH4]+984.898 5687.630 3,601.520 4,685.613 9,263.237 4,265.252 7,349.346 8117TG(18∶1/18∶2/25∶0)[M+NH4]+1 000.929 4903.661 6,701.645 9,601.520 4,265.253 2,263.253 2,365.379 2118TG(18∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+896.773 2599.504 9,263.237 5,337.274 4

(续表2)

NumberLipid specieParent ionMS(m/z)MS2(m/z)119TG(18∶2/18∶2/19∶1)[M+NH4]+912.768 2599.504 9,615.499 9,279.236 5,263.237 7120TG(18∶2/18∶2/20∶1)[M+NH4]+926.819 6629.551 8,599.504 9,263.237 5,293.284 5121TG(18∶2/18∶2/20∶2)[M+NH4]+924.803 8599.504 6,627.535 4,263.236 6,291.268 0122TG(18∶2/18∶2/21∶0)[M+NH4]+942.851 0645.583 3,599.504 9,263.237 5,309.316 5123TG(18∶2/18∶2/22∶0)[M+NH4]+956.866 8659.599 1,599.504 8,263.237 0,323.332 1,397.328 5,337.274 3124TG(18∶2/18∶2/22∶1)[M+NH4]+954.851 4657.582 8,599.503 8,263.237 5,321.315 7125TG(18∶2/18∶2/23∶0)[M+NH4]+970.882 0673.614 7,599.504 7,263.237 5,337.274 6126TG(18∶2/18∶2/24∶1)[M+NH4]+982.882 6685.614 6,599.505 1,263.237 4,349.347 4127TG(18∶2/18∶2/25∶0)[M+NH4]+998.913 5701.645 7,599.504 7,263.253 2,365.379 2128TG(18∶2/18∶3/18∶2)[M+NH4]+894.757 8597.489 5,599.505 0,263.237 5,261.222 0,337.242 5,335.258 9129TG(18∶2/18∶3/18∶3)[M+NH4]+892.742 3597.489 4,595.473 9,261.221 9,263.237 6130TG(18∶2/18∶3/25∶0)[M+NH4]+996.897 9701.645 6,699.630 1,597.489 0,261.221 7,263.253 2131TG(18∶1/18∶1/19∶0)[M+NH4]+918.814 6619.531 0,603.536 2,265.253 1,281.247 7132TG(18∶2/18∶2/19∶0)[M+NH4]+914.783 7599.504 9,617.515 7,263.237 5,281.248 3

2.2 油料作物中脂质成分的相对定量分析

利用MetaboAnalyst作热图比较5种油料作物中定性的132种脂质分子，在相同条件下，同类脂质间的质谱响应具有相似性和可比性，故本实验利用一级质谱中提取离子色谱峰的峰面积对同类脂质进行相对含量比较[19]。分别比较了甘油酯类(包括65种TG以及8种DG)和磷脂类(包括24种PC、18种PE、8种PI、1种PG、1种PS、5种LPC以及2种LPE)，结果如图1和图2所示。

图1 5种油料作物中甘油酯类脂质的相对含量Fig.1 Relative contents of glyceride lipids in five oil cropsA.rapeseed;B.soybean;C.peanut;D.sunflower seed;E.corn

由图1可知，不同油料中的甘油酯类脂质含量不同，油菜籽和玉米中各甘油酯类脂质的含量低于大豆、花生和向日葵籽。成分DG(18∶0/18∶1)、DG(18∶1/18∶1)、DG(16∶0/18∶1)、TG(18∶2/18∶2/20∶0)、TG(18∶1/18∶2/20∶0)、TG(16∶0/18∶1/22∶0)、TG(18∶1/18∶1/21∶0)、TG(16∶0/18∶1/19∶1)、TG(16∶0/18∶1/21∶0)、TG(14∶0/16∶0/18∶1)、TG(18∶2/18∶2/20∶1)以及TG(16∶0/16∶1/18∶2)，在花生中含量较高；成分TG(16∶1/18∶2/18∶2)、TG(16∶0/18∶2/18∶3)、TG(15∶1/18∶2/18∶2)、TG(17∶2/18∶2/18∶2)、TG(18∶2/18∶2/22∶1)、TG(18∶2/18∶2/24∶1)、TG(18∶2/18∶2/25∶0)以及TG(18∶2/18∶2/18∶2)，在大豆中含量较高；而成分TG(16∶0/18∶2/19∶0)、TG(18∶1/18∶1/19∶1)、TG(18∶2/18∶2/19∶0)以及TG(18∶1/18∶1/19∶0)，则在向日葵籽中含量较高。

由图2可知，花生、向日葵籽以及玉米中各磷脂类脂质的含量低于油菜籽和大豆，成分PE(16∶0/16∶0)、PC(16∶0/18∶2)、PC(16∶1/18∶1)、PE(18∶2/22∶0)、PE(16∶0/18∶2)、PC(18∶1/19∶0)、LPC(16∶0)、PC(18∶2/18∶2)、PI(16∶0/18∶2)、PE(16∶0/18∶3)、PE(18∶2/20∶0)以及PC(16∶0/18∶3)，在大豆中含量较高；而成分LPC(18∶1)、PC(18∶1/18∶2)、LPE(18∶1)、PI(18∶1/18∶2)、PE(18∶1/18∶2)、PC(14∶0/18∶1)、PC(16∶0/16∶1)、PC(16∶1/18∶3)、PC(16∶2/18∶2)、PE(15∶0/18∶1)以及PE(16∶0/17∶1)，则在油菜籽中含量较高。脂质成分的含量差异可能是由于不同的油料作物中，其脂肪酸含量有差异，导致合成的脂质含量不同。

图2 5种油料作物中磷脂类脂质的相对含量Fig.2 Relative contents of phospholipids in five oil cropsA.rapeseed;B.soybean;C.peanut;D.sunflower seed;E.corn

3 结 论

本研究建立了基于超高效液相色谱-高分辨质谱的油料作物中脂质成分分析的方法，对油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米5种油料作物中脂质分子进行分析。利用正离子模式下的二级质谱确定甘油酯类脂质的脂肪酸链组成，利用负离子模式下的二级质谱确定磷脂类脂质的脂肪酸组成，共定性出132种脂质分子，并用热图法对5种油料作物中132种脂质成分的相对含量进行了比较，为更好地实现油料作物中脂质成分的应用提供了研究基础。