气相色谱-质谱联用法测定加热卷烟烟草材料中8种凉味剂

王紫燕，韩敬美，袁大林，郑绪东，尚善斋，李志强，任达兵，易伦朝*，汤建国*

1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区红锦路367 号 650231 2.昆明理工大学农业与食品学院，昆明市呈贡区景明南路727 号 650500

凉味剂是薄荷卷烟中最常见的添加剂之一，能修饰卷烟风味，并给消费者带来清凉感，目前在卷烟工业企业应用广泛［1-3］。烟草行业常用的凉味剂有DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、异胡薄荷醇、N-乙基-对薄荷基-3-甲酰胺（WS-3，CAS 号：39711-79-0）、N-（乙氧羰基甲 基）-对 烷-3-甲 酰 胺（WS-5，CAS 号：68489-14-5）、N,2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺（WS-23，CAS 号：51115-67-4）等，这些凉味剂通常以多种成分复配的方式添加于卷烟，进而满足卷烟抽吸口感和实现凉感持久性［4-5］。目前，针对传统烟草制品中凉味剂的分析方法主要有顶空气相色谱法（HS-GC）［1,6］、气相色谱火焰离子化检测法（GC-FID）［7］、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）［8-9］、全二维气相色谱-飞行时间质谱法（GC×GC-TOFMS）［10］、高效液相色谱法（HPLC）［11］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［12］、高速逆流色谱法（HPCCC）［13］等。其中，GC-MS 法具有选择性好、分辨率高、灵敏度高、分析时间短等优点，是目前烟草行业中测定凉味剂应用最广泛的方法［14-18］。采用GC-MS 法测定传统卷烟中凉味剂含量的方法国内外已有文献报道［19-21］，但主要是传统卷烟烟草材料中薄荷醇的定量检测。孙海峰等［21］建立了用无水乙醇萃取传统卷烟烟气、烟丝、滤嘴及添加剂中凉味剂的方法。Reger 等［4］建立了GC-MS 测定烟草制品中薄荷醇及其他烟用香料的方法。近年来，在日趋严峻的控烟环境下，加热卷烟（又名加热不燃烧卷烟）产品正在快速兴起［22］。加热卷烟用烟草材料类型主要有颗粒型（粉末）、烟丝型和薄片型［23］，通常，加热卷烟烟草材料中添加了大量的发烟剂（一般为甘油），以产生气溶胶［24］。加热卷烟烟草材料基质与传统卷烟烟草材料有明显差异。另外，以往文献方法存在样品前处理时间长，样品用量大，灵敏度较低等不足，检测的凉味剂种类也较少。为此，本研究中通过样品前处理条件及色谱条件优化，建立基于GC-MS 技术检测加热卷烟薄片、烟丝及烟草粉末中DL-薄荷醇、乳酸薄荷酯、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、异胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23 等8 种凉味剂的分析方法，旨在为加热卷烟烟草材料中多种凉味剂的同时检测提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

由云南中烟工业有限责任公司技术中心提供含DL-薄荷醇、乳酸薄荷酯、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、异胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23 的加热卷烟烟草材料，主要包括薄片、烟丝和烟草粉末。

乳酸薄荷酯（≥98.0%，上海西园生物技术有限公司）；异胡薄荷醇（≥98.0%，阿法埃沙（中国）化学有限公司）；WS-3（≥99%，上海阿达玛斯试剂有限公司）；WS-5（≥98.0%，上海西园生物技术有限公司）；WS-23（≥99%，上海阿达玛斯试剂有限公司）；DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、苯甲酸丙酯［＞99.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］；乙醇［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；甲醇、异丙醇、正己烷（色谱纯，德国Merck公司）；二氯甲烷（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）。

S-CVS/250/900 涂布机、QS-2A 实验室烟叶切丝机（郑州嘉德机电科技有限公司）；HH-S114 数显恒温水浴锅（常州国立试验设备研究所）；PL7-C平板纸样干燥器（咸阳泰思特试验设备有限公司）；2010plus 气相色谱-质谱联用仪（日本Shimadzu 公司）；XP204 电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）；DB-5MS 色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent 公司）；HU20500B超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；Milli-A10 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 方法

内标溶液：准确称量4 g 苯甲酸丙酯，于100 mL 容量瓶中以乙醇定容，充分摇匀得到质量浓度为40 mg/mL 的内标溶液。

混标储备液：分别准确称取1 g 异胡薄荷醇、DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、WS-3、WS-5 和WS-23，置于10 mL 容量瓶中以乙醇定容，混匀后得到单标储备液。准确移取8种凉味剂单标溶液各5 mL，置于100 mL 容量瓶中以乙醇定容，充分摇匀后得到混合标准储备液。

系列标准工作溶液：分别移取2、20、40、100、200、400 和1 000 μL 混标储备液于10 mL 容量瓶中，再分别加入50 μL 内标溶液，以乙醇定容，充分摇匀后得到标准工作溶液。

1.2.2 样品制备

分别准确称取0.5 g 加热卷烟烟草材料（薄片、烟草粉末和烟丝），置于50 mL 三角瓶中，加入100 μL 内标溶液和20 mL 乙醇，超声5 min；取上清液，用0.45 μm 有机滤膜过滤，得到待测液。

1.2.3 GC-MS 分析条件

进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；分流进样，分流比：50∶1；载气：氦气（≥99.999%），恒流模式；流速：2 mL/min；程序升温：初始温度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 的速率升温至150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 的速率升温至220 ℃，保持1 min；溶剂延迟时间：2 min；电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；传输线温度：280 ℃；扫描方式：全扫描（Scan）；质量扫描范围：50 ～1 000 amu。

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2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

比较了甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷和二氯甲烷作为提取溶剂对样品中凉味剂的提取率。结果（图1）表明：正己烷和二氯甲烷对8 种凉味剂的提取效果较好，但稳定性不足，所测样品相对标准偏差（RSD）分别在1.89%～8.82%和2.02%～9.05%之间；甲醇和乙醇对多数凉味剂的提取效果无显著差异，但乙醇对乳酸薄荷酯、乙酸薄荷酯及WS-3的提取效果强于甲醇，且毒性小，成本更低；异丙醇对大多数凉味剂的提取效果都低于甲醇和乙醇。尽管有研究者［4］用二氯甲烷为提取溶剂提取卷烟中L-薄荷酮、乳酸薄荷酯、DL-薄荷醇、WS-3、WS-23 等物质，且目标物的检出限和定量限与本研究中的结果相近，但正己烷和二氯甲烷的毒性较大，挥发性较强。由于DL-薄荷醇是加热卷烟烟草材料中最常用的一种凉味剂，因此进一步考察了5 种提取溶剂对DL-薄荷醇的提取效果，结果显示，5 种提取溶剂对DL-薄荷醇的提取率顺序为：正己烷＞二氯甲烷＞乙醇＞甲醇＞异丙醇。综合考虑，选择乙醇为提取溶剂。

2.1.2 提取溶剂体积的优化

考察了5、10、20 mL 提取溶剂对样品中凉味剂的提取效果。结果（图2）显示，多数凉味剂提取量随提取溶剂体积的增大而增加，少数凉味剂在15 mL 提取溶剂条件下的提取率最高。综合考虑，选择提取溶剂体积为20 mL。

图2 不同提取溶剂体积下测定的加热卷烟烟草材料中凉味剂含量Fig.2 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different extraction solvent volumes

2.1.3 样品量的优化

对样品用量进行了优化，结果（图3）显示，凉味剂提取率随样品量的增加而增加，但当样品量超过0.5 g 时，凉味剂提取率趋于稳定或减少。因此，选择加热卷烟烟草材料使用量为0.5 g。与文献［21］相比，本研究中使用的样品量更少。

2.1.4 提取方式的优化

比较了回旋振荡和超声振荡两种提取方式对加热卷烟烟草材料中凉味剂的提取效果。结果表明，在相同提取时间下，与回旋振荡方式相比，超声振荡方式的凉味剂提取率更高。因此，采用超声振荡提取方式。

2.1.5 提取时间的优化

比较了5、15、30 min 超声振荡时间对加热卷烟烟草材料中凉味剂提取率的影响。结果（图4）表明，超声振荡5 和15 min 对加热卷烟烟草材料中凉味剂的提取率无显著影响，但略高于超声振荡30 min 下的提取率，这可能是因为超声振荡提取过程能量较高，溶剂和凉味剂随超声振荡时间的延长而损失。因此，为节约时间成本，采用超声振荡5 min。与文献［21］对比，本研究中提取时间显著缩短。

图3 不同样品用量下测定的加热卷烟烟草材料中凉味剂含量Fig.3 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different sample dosages

图4 不同提取时间下测定的加热卷烟烟草材料中凉味剂含量Fig.4 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different extraction time

2.2 色谱条件的优化

分析讨论了载气流量（1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mL/min）、分流比（不分流和分流比为10∶1、20∶1、50∶1、80∶1 和100∶1）和程序升温等条件对实验结果的影响，考察了8 种凉味剂在DB-5MS 色谱柱上的分离效果，以确定适宜的色谱分离条件。结果表明：①随着载气流量的增加，多数凉味剂的峰面积呈上升趋势，峰宽变窄，当流量为2.0 mL/min 后峰面积增加趋缓，峰宽缓慢变宽，为缩短凉味剂出峰时间，在保证方法灵敏度的前提下，选择载气流量为2.0 mL/min。②在分流比较小时，目标物的色谱峰有拖尾现象；在分流比较大时，目标物的色谱峰宽变窄，当分流比为50∶1 时，各成分的分离效果较好，因此选择分流比为50∶1。③调整程序升温条件，对同一标准工作溶液和样品溶液进行分析，分析内标物与目标物的出峰情况，最终确定了1.2.3节所示的程序升温条件。在优化的色谱条件下，样品溶液中的目标物与杂质峰实现了较好分离，可以满足实验要求。优化条件下样品色谱图见图5。

图5 优化的GC-MS 条件下样品溶液色谱图Fig.5 Chromatogram of sample solution under optimized conditions

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线、方法的检出限和定量限

取7 个不同浓度凉味剂混合标准工作溶液（含内标），采用1.2 节色谱质谱条件进行GC-MS 分析，以各凉味剂与内标的峰面积比为纵坐标，相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。将最低浓度的标准工作液稀释10 倍后，平行测定10 次，以所得测定结果标准偏差的3 倍作为方法的检出限（LOD），以所得测定结果标准偏差的10 倍作为方法的定量限（LOQ）。本方法线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限见表1。结果显示，在测试范围内，质谱信号与目标物的浓度呈良好线性关系，所有回归方程的相关系数均≥0.999 6，方法的检出限和定量限分别为0.25～0.54 μg/g 和0.83～1.80 μg/g。

表1 8 种凉味剂的线性范围、回归方程、相关系数、检出限与定量限(n=5)Tab.1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LOD)and limits of quantification(LOQ)of eight cooling agents(n=5)

2.3.2 方法回收率及精密度

取6 份标准样品溶液，在优化的色谱质谱条件下分别进样分析，计算各组分与内标峰面积比的相对标准偏差（RSD），考察精密度。取混标储备液进行分析，连续进样5 次，计算各组分峰面积与内标峰面积比的相对标准偏差（RSD），考察日内精密度，连续5 d 进样，考察日间精密度。取已知含量的加热卷烟烟草材料，分别添加低、中、高3个水平的凉味剂混标3 份，测定添加前后样品中各凉味剂含量，考察回收率。重复性、精密度与回收率结果见表2。可以看出：所有组分的RSD 均小于2.07%；日内精密度RSD≤2.60%，日间精密度RSD≤3.35%；低、中、高3 个水平下加标回收率分别为85.66%～109.36%、96.08%～105.47%和94.29%～104.12%。可见，建立的测定方法精密度和重复性良好，回收率较高，适用于加热卷烟烟草材料中凉味剂的检测。

表2 8 种凉味剂在加热卷烟烟草材料中的精密度和回收率(n=3)Tab.2 Precision and recovery results of eight cooling agents in tobacco materials for heated tobacco products(n=3)

2.3.3 样品分析

将建立的方法应用于加热卷烟烟草材料（薄片、烟草粉末、烟丝）中凉味剂的检测，每个样品平行测定3 次，结果如表3 所示。结果表明，加热卷烟烟草材料中大多含有1 种或几种凉味剂，其中普遍含有DL-薄荷醇。另外，添加的主要凉味剂有L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、异胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23。且这些凉味剂在薄片、烟草粉末和烟丝中的含量分别为0.65 ～29.40、0.15 ～6.23 mg/g 和0.01 ～3.94 mg/g（n=3），RSD 在0.31%～2.14%之间。可见，本方法精密度良好。

表3 不同加热卷烟烟草材料中凉味剂含量及其相对标准偏差(n=3)Tab.3 Cooling agent content and its RSDs in different tobacco materials for heated tobacco products(n=3)

续表（3）

3 结论

通过对提取溶剂、提取溶剂体积、样本用量、提取方式及提取时间等优化，建立了以苯甲酸丙酯为内标，利用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）测定加热卷烟烟草材料中8 种凉味剂含量的检测方法。该方法前处理简单、分析速度快且灵敏度较高，适用于加热卷烟烟草材料中凉味剂的定量检测。加热卷烟烟草材料薄片、烟草粉末和烟丝样品中8种凉味剂的实测含量分别在0.65 ～29.40、0.15 ～6.23 和0.01 ～3.94 mg/g（n=3）之间，RSD 为0.31%～2.14%。本研究可为含有多种凉味剂的加热卷烟烟草材料的分析测定提供方法参考。