碱性体系下美拉德反应产物中关键香味成分的种类及质量分数

朱龙杰，张 华，吴 洋，陈晶波，曹 毅，廖惠云，王 瑞，朱怀远，沈晓晨，毛淑蕊

江苏中烟工业有限责任公司技术中心，南京市兴隆大街29 号 210019

美拉德反应是由氨基酸和还原糖或其他羰基化合物之间发生的一系列反应的总称，反应产物具有一定风格及香味特征，很多具有自然优美、令人愉悦的香气，同时还含有还原酮等活性物质，具有抗氧化抗自由基能力，因此美拉德反应产物在香料、食品、烟草、制药等领域均有重要应用［1-7］。关于美拉德反应产物的研究，主要集中在反应动力学机理研究、反应条件优化、产物的检测分析、香气的感官评价及加香应用等方面［8-20］。

对于美拉德反应的研究，前人主要集中在反应温度、反应时间、体系水分、体系pH 等反应条件的优化研究方面［9-13］。一般认为反应体系pH 升高，会促进美拉德反应进行［13］。但是文献［21-22］报道，随美拉德反应的进行，初始呈碱性的美拉德反应液会迅速地变为酸性。尽管这种现象在一些研究中被较多提及，但相应的维持碱性条件的探索尝试却较少，也未有比较不同碱性体系下美拉德反应体系pH 变化的研究。而对于美拉德反应产物主要成分的种类和质量分数的分析，还较多地停留在定性阶段［10-11，14-17］，开展美拉德反应产物香味物质定量的工作较少，且少数定量研究一般只选择某些特定的美拉德产物进行分析［12，18］，鲜见有全面开展针对美拉德反应产物中关键香味物质种类和质量分数研究的文献报道。此外，对于一些只选择少数几种糖和氨基酸为原料制备美拉德反应产物并进行检测分析或应用的研究［17-20］，由于此类方法没有完整地研究美拉德反应产物，因此难以深入探讨美拉德反应产物中香味物质的形成机制，也无法系统获知美拉德反应产物中香味物质种类和质量分数的分布规律。

本研究中以不同糖类和氨基酸的反应产物为研究对象，通过优化反应条件，建立合适的美拉德反应产物制备方法，研究不同糖类和氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分的种类和质量分数，并重点分析了美拉德反应产物中香味物质质量分数的分布规律，旨在为香料和食品行业等准确评价和应用美拉德反应产物提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-脱氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-半胱氨酸（BR），氢氧化钠、碳酸钾、丙二醇（AR）（国药集团化学试剂有限公司）；丙酸苯乙酯（＞97%，阿法埃莎化学有限公司）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

ME203 电子天平（感量0.001 g）、S210 型pH 计（分 辨 率0.001）（瑞 士Mettler Toledo 公 司）；ZNCL-G 型智能恒温磁力搅拌器（河南爱博特科技发展有限公司）；R215 型旋转蒸发仪（瑞士Büchi 公司）；6890N-5975C 型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；0.22 μm 有机相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 美拉德反应产物的制备

称取5 mmol 糖和5 mmol 氨基酸，加入50 mL圆底烧瓶中，再加入2.5 mmol 碳酸钾（当氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸时，碳酸钾的量为5 mmol）使反应液的pH 维持在9～10。以20 mL 丙二醇和5 mL 超纯水的混合液作为反应溶剂，升温加热至100 ℃，反应6 h。

1.2.2 两种美拉德反应体系下pH 的检测

校正pH 计，使测量范围为pH 3.00～10.00，采用两种方法对美拉德反应体系pH 的变化情况进行监测：一种方法是采用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节反应液初始pH 至9～10，然后加入同一糖类和不同氨基酸进行美拉德反应；另一种方法是根据同一糖类和不同氨基酸的物质的量，加入一定量的碳酸钾使反应液的pH 至9～10 后进行美拉德反应。反应结束后，使用pH 计检测反应液的pH。

1.2.3 美拉德反应产物中香味成分的GC-MS 检测与分析

取2 mL 美拉德反应液加入分液漏斗中，加入100 μL 内标浓度为1 mg/mL 的丙酸苯乙酯二氯甲烷溶液和15 mL 超纯水，用二氯甲烷（20 mL×2）萃取。合并有机相，加入无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩至1 mL，过0.22 μm 有机相滤膜，采用GC-MS 法进行分析。分析条件：

色谱柱：Agilent DB-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；进样口温度：260 ℃；载气：He；载气流速：1.0 mL/min；进样量：1 μL；分流比：10 ∶1；升 温 程序：60 ℃（1 min）10 ℃/min 280 ℃（15 min）；传输线温度：280 ℃；MS 电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描范围：30～450 amu；溶剂延迟：3 min。

采用Nist14 和Wiley 标准质谱图库检索定性，以匹配度≥85%认为可信。以添加的丙酸苯乙酯为内标物质，假定检出的香味物质校正因子为1，回收率为100%，利用公式（1）计算美拉德反应产物样品中某一待测香味成分的质量，利用公式（2）计算美拉德反应产物中香味成分的总质量。

其中：Mi—待测香味成分的质量；Ms—内标物质的质量；Ai—待测香味成分的峰面积；As—内标物质的峰面积；MT—美拉德反应产物中香味成分总质量。

2 结果与讨论

2.1 两种美拉德反应体系中pH 的变化对比

为了对比使用氢氧化钠和碳酸钾对维持美拉德反应体系pH 的效果，选择以葡萄糖和不同氨基酸为原料进行美拉德反应，反应结束后检测每种氨基酸美拉德反应产物反应液的pH，结果如表1所示。可知，当采用氢氧化钠时，美拉德反应末期反应液的pH 几乎均从碱性变为酸性。其原因可能是由于美拉德反应体系中不断地生成酸性物质，中和了体系的碱性，并且有些氨基酸的pKa值较低，也会促进反应体系pH 转为酸性，因此采用氢氧化钠调节美拉德反应液初始pH 为碱性的方法难以真正维持反应液体系为碱性。当采用碳酸钾时，美拉德反应末期反应液的pH 均能维持在碱性。原因可能是由于碳酸钾为中等碱性物质并能起到持续中和作用，且可以根据原料的量按照一定比例添加而不会造成反应液的碱性过强。随着美拉德反应的进行，生成的酸性物质不断被中和，但只要碳酸钾的量足够，溶液就会维持碱性环境，美拉德反应将不会受到抑制。因此，采用定量添加碳酸钾的方法可以有效维持美拉德反应在碱性环境下进行，比添加氢氧化钠调节反应液初始pH为碱性的方法更能有效地促进美拉德反应。

2.2 4 种糖类与多种氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分的鉴定

在美拉德反应糖类原料中，最常见的为五碳糖和六碳糖，其中有不少物理和化学性质相似的异构体。由于异构体糖类的反应活性和反应产物较为接近，因此选择两两非异构体葡萄糖、果糖、木糖和脱氧核糖作为美拉德反应的糖原料。将葡萄糖、果糖、木糖和脱氧核糖分别与20 种氨基酸进行两两组合反应，共得到80 种美拉德反应的产物。

对80 种美拉德反应产物进行GC-MS 定性分析，鉴定出的主要成分有杂环类、芳香族类、烯酮（醛）类、醇类、醚类、大分子脂肪族化合物等。其中，杂环类、芳香族类和烯酮（醛）类化合物具有典型香气特征［23-26］。由于以上3 大类物质的种类和质量分数相对较多且具有香味化合物相似的特征分子骨架，因此选定杂环类、苯环类和烯酮（醛）类化合物作为关键香味成分研究对象，其中杂环类化合物包括氮杂环、氧杂环和硫杂环3种。

表1 葡萄糖美拉德反应末期反应液pH 对比Tab.1 Solution pH values at the end of Maillard reaction by glucose

美拉德反应产物中检测出的含氮杂环化合物是种类和质量分数最丰富的化合物，主要有吡咯类（10 种）、吡啶类（6 种）、吡嗪类（32 种）。含氮杂环类化合物存在于绝大多数的美拉德反应产物中，经鉴定出的氮杂环化合物共有48 种，其分子结构如图1 所示。美拉德反应产物中检测出的含氧杂环化合物种类和质量分数不多，主要有呋喃类（3 种）、呋喃酮类（1 种）和麦芽酚类化合物（1种），主要存在于葡萄糖和果糖类美拉德反应产物中。美拉德反应产物中检测出的含硫杂环化合物种类和质量分数很少，仅有噻唑类1 种，只存在于半胱氨酸美拉德反应产物中。经鉴定出的含氧杂环和含硫杂环化合物共有6 种，其分子结构如图2所示。在美拉德反应产物中，检测出的芳香族类化合物种类和质量分数较少，主要为醇类化合物（2 种）、醛类化合物（2 种）、酮类化合物（1 种），主要存在于含苯环的氨基酸美拉德反应产物中，经鉴定出的芳香族类化合物共有4 种，其分子结构如图3 所示。在制备的美拉德反应产物中，检测出的烯酮（醛）类化合物种类和质量分数较丰富，主要为开链烯酮（醛）类（3 种）和闭环烯酮类（3种）化合物，主要存在于亮氨酸和异亮氨酸等特定的美拉德反应产物中，经鉴定出的烯酮（醛）类化合物共有6 种，其分子结构如图4 所示。

图1 美拉德反应产物中的含氮杂环化合物Fig.1 Structures of nitrogen-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

图2 美拉德反应产物中的含氧和含硫杂环化合物Fig.2 Structures of oxygen-and sulfur-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

图3 美拉德反应产物中的芳香族类化合物Fig.3 Structures of aromatic compounds produced by Maillard reaction

图4 美拉德反应产物中的烯酮（醛）类化合物Fig.4 Structures of ketene and enal compounds produced by Maillard reaction

2.3 4 种糖类与多种氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分的总质量

对美拉德反应产物谱图中的所有成分先逐一进行标准谱库检索定性，再选择美拉德反应产物中的杂环类、芳香族类、烯酮（醛）类化合物3 大类关键香味成分进行定量分析，最后根据公式（1）和公式（2）计算得到美拉德反应产物中80 种关键香味成分的总质量，结果见表2。

表2 美拉德反应产物中关键香味成分的总质量①Tab.2 Total contents of key aroma components in Maillard reaction products （mg）

表2 中除列出了每个美拉德反应对应产物中香味物质的总质量，还分别横向和纵向统计了4种糖类和同一种氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分总质量之和以及不同氨基酸与同一糖类美拉德反应产物中关键香味成分总质量之和，用于辅助分析糖类和氨基酸的反应活性以及美拉德反应产物中关键香味成分质量大小的内在规律。在美拉德反应产物关键香味成分总质量之和的横向比较中，4 种糖类的美拉德反应产物香味成分总量为果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脱氧核糖。

美拉德反应产物关键香味成分总质量之和的纵向比较结果表明，不同氨基酸美拉德反应产物关键香味成分质量差别较为明显，按照质量多少将其分为3 个档次：第一档总质量ΣMT≥30 mg，对应的4 种氨基酸原料分别为亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；第二档总质量10 mg≤ΣMT＜30 mg，对应的9 种氨基酸原料分别为丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、组氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸；第三档总质量ΣMT＜10 mg，对应的7 种氨基酸原料分别为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

2.4 糖类和氨基酸影响美拉德反应中关键香味成分总质量的机制探讨

根据文献［9-10］报道，不同的糖原料进行美拉德反应活性大小的顺序是木糖＞核糖＞阿拉伯糖＞山梨糖＞葡萄糖＞果糖，其中五碳糖的反应活性高于六碳糖，葡萄糖的反应活性高于果糖。尽管糖类的反应活性大小可以通过反应液色泽及吸光度判断，但美拉德反应产物中关键香味成分的生成情况还需进一步通过检测分析进行判断。从表2 可知，美拉德反应产物中关键香味成分的总质量与糖类的反应活性并不正相关。其原因在于，美拉德反应是一个复杂的反应体系，一些香味成分的产生与糖类的分子结构和反应中间体构型紧密关联［14］。在反应中，如果产生的中间体结构不利于香味成分分子结构的生成，那么最终得到的香味成分总质量就会减少，如一些重要的杂环类化合物。

由于吡嗪类氮杂环化合物在多种美拉德反应产物的香味成分中占主导地位，故可对吡嗪类香味成分的形成机制进行重点分析。根据本研究的数据结合文献中有关美拉德反应中间体的研究结果［27-30］，分析了糖类在美拉德反应中形成吡嗪类化合物的反应机制，其重要中间体二羰基化合物的反应路线如图5 所示。首先，果糖先与氨基酸生成果糖胺，然后果糖胺经过一系列Heyenes 重排、1,2-重排反应和脱氨基后生成活泼性高且更容易进行反应的含醛基的二羰基化合物，接着二羰基化合物与氨基酸作用进行Strecker 降解生成活泼的氨基酮，最后氨基酮之间缩合生成吡嗪类杂环化合物。而由葡萄糖生成的葡萄糖胺经过Amadori 重排、2,3-重排反应和脱氨基后生成含酮基的二羰基类化合物，该类二羰基化合物由于反应活性较低，继续反应生成吡嗪类杂环化合物的质量分数较少。因此，尽管果糖是酮糖，葡萄糖、木糖、脱氧核糖是醛糖，且初期生产糖胺的活性顺序是醛糖大于酮糖，但在后期通过中间体二羰基化合物生成氨基酮的容易程度却是酮糖大于醛糖。因此以果糖为原料的美拉德反应产物中吡嗪类关键香味成分的质量分数最高。

图5 葡萄糖和果糖美拉德反应中二羰基化合物的生成机制［27-30］Fig.5 Formation mechanisms of dicarbonyl compounds formed in Maillard reactions by glucose and fructose

美拉德反应中另一主要原料氨基酸由于取代基R 的不同，造成氨基酸的物理性质和化学活性各不相同，对美拉德反应中香味物质的生成也有较大影响。从不同氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分的总质量比较中可以看出，美拉德反应产物中关键香味成分总质量较小的氨基酸有以下几个特点：①R 的碳链太短（甘氨酸）或太长（精氨酸）；②R 中含有羟基或巯基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）；③氨基酸分子中可形成闭环结构（脯氨酸）。这些氨基酸分子的空间结构和反应活性或许是美拉德反应中一些重要中间体形成的不利因素，影响美拉德反应产物中一些关键香味成分的生成，造成关键香味成分的总质量偏低。

3 结论

①建立了碱性体系的美拉德反应产物制备方法。②对所制备的80 种美拉德反应产物进行GC-MS 定性分析，共鉴定出含氮杂环化合物48种，含氧杂环化合物5 种，含硫杂环化合物1 种，芳香族类化合物4 种，烯酮（醛）类化合物6 种。③在众多关键香味成分中，含氮杂环化合物种类多、质量分数大，存在于绝大多数的美拉德反应产物中；含氧杂环化合物种类和质量分数较少，主要存在于葡萄糖和果糖类美拉德反应产物中；含硫杂环化合物种类和质量分数很少，只存在于半胱氨酸的美拉德反应产物中；芳香族类化合物和烯酮（醛）类化合物种类和质量分数均较少，存在于一些特定氨基酸的美拉德反应产物中。④糖类美拉德反应产物关键香味成分总质量大小为果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脱氧核糖。⑤不同氨基酸美拉德反应产物中关键香味成分总质量差别明显，其中总质量较高的氨基酸有亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。