烟草NtGT-2 基因的克隆及表达分析

赵利杰，郑 美，王 中，谢小东，罗朝鹏，李宏光，武明珠*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001 2.湖南省烟草公司郴州市公司，湖南省郴州市北湖区燕泉北路 423000

Trihelix 转录因子是调节植物生长发育的一类重要转录因子［1］。Trihelix 转录因子含有保守的三螺旋结构域［2-3］，该结构域能特异性地与基因启动子区域的GT 元件发生特异性结合，所以又称为GT 因子［4-6］。Trihelix 转录因子的DNA 结合域富含碱性、酸性氨基酸，并有3 个串联的α-螺旋结构域，能够形成螺旋-环-螺旋-环-螺旋的构象，这种构象通常以1 个或2 个的形式存在于Trihelix 转录因子氨基酸结构的N 端和C 端［7］。根据Trihelix转录因子家族保守域的结构特征可将其家族分为5 个亚家族：GT-1、GT-2、GTγ、SH4 以及SIP1［8］。研究发现Trihelix 转录因子家族在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中有30 个成员［9］，在水稻（Oryza sativa L.）中有31 个成员［10］，在大豆（Glycine max(Linn.)Merr.）中有11 个成员［11］，在辣椒（Capsicum annuum L.）中有28 个成员［12］。

Trihelix 转录因子不仅参与光应答反应［13］，也参与植物生长发育的多个过程，包括植物早期胚胎的建成［14-15］、气孔和表皮毛的形成［16-17］、种子离层［18］、花器官的形成等［19-20］。另外，Trihelix 转录因子在抵御生物（细菌病原体）和非生物胁迫（干旱、低温和盐胁迫）中也具有重要作用［21］。例如：用丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（PsD）对拟南芥进行30 min 的胁迫处理后，发现AtGT-3b 的转录迅速增加［22］；大豆的GmGT-2A 和GmGT-2B 基因转到拟南芥中可提高转基因拟南芥对盐、低温和干旱胁迫的耐受性［23］；白杨PtaGTL1 可以通过调节气孔密度影响蒸腾作用，进而提高转基因植株的耐寒性［24］；在拟南芥的基因组中鉴定出一个受低温胁迫、盐胁迫和ABA 诱导的GT 因子AtGT2L，该蛋白在应对非生物胁迫过程中具有重要作用［25］。

烟草（Nicotiana tabacum）作为一种重要的经济作物和模式植物，目前关于其Trihelix 转录因子的研究较少。为此，在普通烟草K326 中克隆出一个Trihelix 转录因子NtGT-2 基因，对该基因进行相关生物信息学分析，并分析NtGT-2 基因在烟草不同组织中的表达情况，以及在植物激素脱落酸（Abscisic acid，ABA）、高盐（200 mmol/L NaCl）、低温（4 ℃）及聚乙二醇6000（Polyethylene Glycol，PEG）胁迫处理后的表达情况。旨在为揭示该基因的功能及烟草抗逆性品种改良提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 烟草材料

普通烟草（Nicotiana tab acum）品种K326 栽培于国家烟草基因研究中心的人工气候温室，采集盛花期第5（成熟叶）、第15 叶位叶片（幼叶）、茎秆、茎节、侧根、须根、花、花蕾及腋芽，液氮速冻后在-80 ℃冰箱中保存备用。

K326 的种子经10%NaClO 消毒后播种于无菌培养瓶中（二分之一MS 培养基+1.5%琼脂），待幼苗长至5～6 片真叶时将幼苗移植到去离子水中培养1 d，挑选长势一致的幼苗分别进行PEG6000（15%）、低温（4 ℃）、200 mmol/L NaCl和10 μmol/L ABA水培处理，在处理0、1、3、6、12 和24 h 后取样，每个处理设置3 个独立重复，每个重复取3 株长势一致的烟苗，经液氮速冻后在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 烟草总RNA 的提取和cDNA 合成

使用ExPro 烟草RNA 提取试剂盒（北京密码子生物科技有限公司）提取烟草总RNA，并使用DNase I 柱上消化试剂盒(RNase free)去除DNA，具体流程参照试剂盒说明书。采用NanoDrop 2000超微量分光光度计［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］测定RNA 含量，计算A260/A280、A260/A230值，同时测定RNA 的完整性。选择完整性较好和纯度较高的总RNA 进行cDNA 的合成，反转录按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］的说明书进行。

1.3 烟草NtGT-2 基因全长克隆

根 据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 番 茄SlGT2 的基因序列，在中国烟草基因组数据库（www.tobaccodb.org）中进行搜索，对得到的相似性最高的基因用Primer Premier 6 设计引物，上游引物NtGT-2-C-F：5'-ATGGAACTCCTCACTGAC-3'，下 游引物NtGT-2-C-R：5'-TTCTGTCTCACTCTTCACA-3'，并由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 反应体系为20µL，包括2 μL cDNA、上下游引物各1 μL、6 μL ddH2O、10 μL PremixTaq。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60～90 s，循环35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

对PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］对目的片段进行切胶回收，将纯化回收的产物连接到pClone007 载体上（北京擎科生物科技有限公司），并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α（上海生工生物工程有限公司），涂板，37 ℃恒温培养箱过夜，挑取单菌落，37 ℃摇床摇菌5 h 左右（200 r/min），以2 μL 菌液为模板进行PCR验证是否为阳性克隆。将验证出含有目的片段的菌液送由北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.4 烟草NtGT-2 蛋白生物信息学分析

使用ORF（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线软件将烟草的NtGT-2 序列翻译成氨基酸序列；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析NtGT-2 蛋白中各种氨基酸含量、理论分子量和 等电点；Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）对NtGT-2 蛋白的亲、疏水性进行分析；PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）分 析NtGT-2蛋白细胞核定位信息；SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽，SMART 在线分析软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtGT-2 蛋白的保守结构域；用PSIPRED 软件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预 测NtGT-2 蛋白的二级结构；SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）预测NtGT-2 蛋白的三级结构模型；用NCBI Blast 在线工具进行核酸及氨基酸序列的同源性比对，搜索并下载相关序列；用DNAMAN 软件对NtGT-2 蛋白序列进行氨基酸序列多重比对分析；使用 MEGA 7.0 软件，运用邻接法（Neighbor-joining，NJ）对蛋白序列进行比对并构建系统进化树。

1.5 烟草NtGT-2 基因表达分析

采用实时荧光定量PCR 技术分析NtGT-2 基因的相对表达量。根据基因克隆得到的NtGT-2基因序列设计荧光定量PCR 引物，上游引物NtGT-2-q-F：5'-TCATCCAGCCTCCGTTAT-3'，下游引物NtGT-2-q-R：5'-TCATCAGAGTCTCGTCCAT-3'；以烟草的L25 基因为内参基因，上游引物L25-q-F：5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'，下 游 引 物L25-q-R：5'-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'。定量PCR 所用仪器为Bio-Rad CFX96（美国伯乐公司），每个生物学样品3 次独立重复。反应体系：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各1 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 至20 μL。反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45 个循环。反应结束后，根据得到的CT值，用2-△△CT方法计算相对表达量［26］。以盛花期的成熟叶和不同处理的0 h 的相对表达量为1，基因的相对表达量为该基因与对照处理组的比值。

2 结果与分析

2.1 烟草NtGT-2 基因克隆

以烟草幼苗的cDNA 为模板，通过设计的特异引物进行PCR 扩增，得到1 条长度约为1 300 bp 左右的条带（图1）。将切胶回收纯化后的PCR 产物进行测序，测序得到的CDS 序列全长为1 176 bp，共编码391 个氨基酸。

图1 NtGT-2 基因的PCR 电泳图Fig.1 PCR electrophoretogram of NtGT-2

2.2 烟草NtGT-2 生物信息学分析

NtGT-2 基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）和水稻（Oryza sativa L.）的GT-2 核苷酸序列相似性较低，其相似度分别为32.97%、34.75%和30.87%。NtGT-2 基因与茄科植物的GT-2序列相似性较高，与辣椒（Capsicum annuum L.）、番茄（Solanum lycopersicum）和 马 铃 薯（Solanum tuberosum L.）的GT-2 序列相似度分别为87.89%、87.80%和87.64%。因此把该基因命名为NtGT-2。

利用MEGA 7.0 软件对不同物种氨基酸序列进行比对，并采用邻接法（NJ）构建系统进化树。结果表明，NtGT-2 与拟南芥（AtGT-2，AtDF1-like，AtGTL1，AtPTL，AtGT2L）、大 豆（GmGT-2A，GmGT-2B）和豌豆的PsDF1 等GT-2 亚家族成员亲缘关系较近，在进化上都属于GT-2 家族分支，证明NtGT-2 属于GT-2 亚家族成员（图2）。利用DNAMAN 软件对烟草（NtGT-2）、土豆（StGT-2）、番茄（SlGT-2）、野生番茄（SpGT-2L）、枣（ZjGT-2）、拟 南 芥（AtGT-2L、AtGTL1 和AtGT2L）、大 豆（GmGT-2A）、水稻（OsGT-2）和豌豆（PsDF1）蛋白的C 端Trihelix 保守结构域进行比对分析，结果显示，不同物种的Trihelix 保守结构域具有高度相似性，且NtGT-2 的Trihelix 保守结构域符合GT-2 亚家族DNA结合域螺旋-环-螺旋-环-螺旋的特点，进一步表明NtGT-2蛋白属于GT-2亚家族成员（图3）。

图2 植物Trihelix 转录因子氨基酸序列进化树Fig.2 Evolutionary tree of amino acid sequences of Trihelix transcription factors from different plants

图3 烟草NtGT-2 蛋白与其他物种GT-2 蛋白多重序列比对Fig.3 Multiple sequence alignment of tobacco NtGT-2 protein and GT-2 protein of other species

用ProtParam 在线软件对烟草NtGT-2 蛋白的氨基酸序列进行分析，结果显示，该蛋白预测分子量为45.01 kDa，等电点为5.80。富含极性氨基酸（Ser、Thr、Lys、Tyr 等151 个）和 疏 水 性 氨 基 酸（Thr、Trp、Phe、Val、Lue、Ala 等123 个）。预测蛋白的不稳定系数为65.54%，表明NtGT-2 蛋白不稳定。用Protscale 在线分析软件对该蛋白的亲疏水性进行预测，结果显示，亲水值绝对值最大为4.189，疏水值绝对值最大为1.633，疏水区域大于亲水区域，推测该蛋白为疏水性蛋白。用PSORT在线分析软件对NtGT-2 蛋白序列进行细胞定位预测，预测结果显示，该蛋白定位于细胞核中。

蛋白的二级结构预测结果表明，NtGT-2 蛋白的二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成，具有典型的螺旋-环-螺旋-环-螺旋的构象（图4），符合Trihelix 转录因子家族的蛋白二级结构特征。用SMART 预测NtGT-2 的保守结构域，发现该蛋白C 端含有一个Trihelix 保守结构域（SANT 结构域），此外该蛋白还含有一个卷曲螺旋结构域（Coiled-coil结构域）。SWISS-MODEL 预测NtGT-2 蛋白的三级结构，并以拟南芥GT-1 结构为模型构建了NtGT-2 蛋白的三级结构图（图5）。

图4 NtGT-2 蛋白二级结构预测Fig.4 Prediction of secondary structure of NtGT-2 protein

图5 NtGT-2 蛋白三级结构预测Fig.5 Prediction of tertiary structure of NtGT-2 protein

2.3 烟草NtGT-2 基因表达分析

利用实时荧光定量PCR 分析NtGT-2 基因在烟草盛花期不同组织中的表达情况，发现NtGT-2 基因在不同组织中均有表达，在茎节、茎秆及腋芽中的表达量较高，在花和花蕾中表达量次之，在叶片（幼叶，成熟叶）和根（侧根，须根）中的表达量最低（图6），可见NtGT-2 基因具有组织表达差异性。

烟草NtGT-2 基因在ABA 和各种胁迫处理不同时间的实时荧光定量PCR 结果表明，ABA 处理后NtGT-2 基因表达呈先上升后下降再上升的趋势，ABA 在1、6 及12 h 可显著诱导NtGT-2 基因表达（图7 A）。在200 mmol/L NaCl 处理后，NtGT-2基因呈先上升后下降的趋势，在处理1 h 的NtGT-2基因的表达量显著上升，随后呈不断下降的趋势，24 h 的表达量降至0 h 时的水平，下降了约40%（图7 B）。在4℃低温处理时，NtGT-2 基因的表达量和ABA 处理类似，呈先上升后下降再上升的趋势，1 h 较0 h 的表达量显著上升，处理12 h 表达量上升最多（达104%），处理24 h 后表达量显著下降（图7 C）。在15%的PEG6000 模拟干旱处理下，NtGT-2 基因的表达量整体呈下降趋势，1、3、6、12及24 h 的表达量均低于0 h 水平（图7 D）。可见，在不同的胁迫处理下，NtGT-2基因的表达模式不同。

图6 NtGT-2 基因在烟草盛花期不同组织中的表达Fig.6 Expressions of NtGT-2 in different tissues during flowering stage of tobacco

图7 NtGT-2 基因在不同胁迫处理下的表达模式分析Fig.7 Expression patterns of NtGT-2 gene under different stress treatments

3 讨论

目前在烟草中已鉴定出多种Trihelix转录因子，比如GT-1家族的NtB2F基因参与光应答反应［13,27-28］，SIP1 家族的NtSIP1 基因参与细胞增殖［29］，而对烟草的Trihelix 转录因子的GT-2 家族的研究较少。本研究中通过基因克隆法从烟草中克隆了一个Trihelix 转录因子基因，命名为NtGT-2。SMART 在线软件预测结果显示在NtGT-2 蛋白的C 端含有一个Trihelix 家族典型的Trihelix 保守结构域（SANT结构域），N 端未发现有保守结构域［30］。这与之前研究发现拟南芥GT-2 亚家族成员At5g47660 的N端也无保守结构域的结果一致［8］。此外，NtGT-2 蛋白含有一个卷曲螺旋结构域（Coiled-coil 结构域），该结构域与转录因子的二聚化或多聚化有关［2］。

NtGT-2 基因在烟草的各个组织中均有表达，但NtGT-2 的基因表达具有组织差异性，其在茎节中的表达量最高。这与在大豆中的研究结果类似，大豆GmGT-2A基因在大豆的茎中的表达量最高，研究还发现GmGT-2B 在豆荚中的表达量最高［23］。说明GT-2 亚家族的成员在植物的生长发育过程中的表达模式有一定的相似性和差异性，推测与植物的生长发育过程中不同的Trihelix 转录因子具有不同的调控功能有关。

对烟草进行ABA、高盐、低温及PEG 胁迫处理，发现NtGT-2 均有不同程度的响应。根据NtGT-2 的表达趋势推测其在ABA、低温胁迫中具有正向调控的作用，在PEG 诱导的渗透胁迫和高盐胁迫中具有负调控作用。例如，棉花GhGT-2 在ABA 胁迫下具有正向调控作用，GhGT29 在低温和ABA 胁迫中都具有正向调控作用，GhGT30 在干旱胁迫处理下具有负向调控作用［31-33］。这与之前研究的Trihelix 转录因子的GT-2 亚家族是植物在应对高盐胁迫、低温胁迫和干旱胁迫的重要响应因子,在植物抗逆性反应中扮演着重要作用的结果一致［21］。烟草NtGT-2 基因在烟草逆境胁迫中的调控途径还需进一步研究,以进一步明确NtGT-2基因功能，为改良烟草抗逆性提供理论依据。

4 结论

通过同源克隆法从普通烟草品种K326 中克隆到一个GT 基因，蛋白结构分析和系统发育分析的结果显示，NtGT-2 属于GT-2 亚家族，命名为NtGT-2。荧光定量PCR 结果显示NtGT-2在烟草不同组织中表达具有差异性，在茎秆茎节中表达量较高，在叶片和根中表达量较低。该基因对植物激素ABA 处理、高盐、低温及PEG 的胁迫处理具有不同程度的响应，说明该基因参与烟草逆境胁迫的应答反应。