碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌临床分布及耐药基因检测

蔡心安，蔡龙啸，闫 敏,姚慧琳

1.中国人民解放军联勤保障部队901医院检验科，安徽合肥 230031；2.安徽医科大学第一临床医学院，安徽合肥 230022;3.安徽省淮北矿工总医院检验科，安徽淮北 235000

碳青霉烯类抗菌药物是一类抗菌谱广泛的抗菌药物，对各类β-内酰胺酶十分稳定，因此成为治疗肠杆菌科细菌所致感染的首选药物[1]，但随着临床的广泛使用，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌出现，给临床治疗带来极大困难。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的主要耐药机制是产碳青霉烯酶和高产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC酶)或者合并膜孔蛋白缺失[2]。不同地区或不同医院的细菌耐药机制会有所差异，为了解中国人民解放军联勤保障部队901医院CRKP的临床分布及耐药机制，本研究采用PCR法对2017年1月1日至2017年12月31日在中国人民解放军联勤保障部队901医院(以下简称本院)住院患者感染的CRKP进行碳青霉烯酶基因及其他β-内酰胺酶基因进行研究，为临床治疗感染及预防院内感染提供帮助，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 收集2017年1月1日至2017年12月31日在本院住院患者的各类临床标本中分离出的非重复CRKP 23株。其中包括痰标本16例，分泌物标本3例，导管标本2例，血液标本1例，尿液标本1例。

1.1.2试剂与仪器 由BD公司PHNX10进行鉴定及药敏试验，抗菌药物氨苄西林、左氧氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶、亚胺培南、头孢吡肟、头孢唑啉标准品均购自中国药品生物制品鉴定所。药敏纸片亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢唑啉、氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟均购自英国Oxoid公司。水解酪蛋白琼脂为天达诊断试剂公司产品，PCR扩增试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等为北京天根公司产品。

1.2方法

1.2.1可疑产碳青霉烯酶菌株筛选 仪器法报告的亚胺培南或美罗培南耐药肺炎克雷伯菌均作为可疑株，用K-B法对这些可疑株进行复检，以两种方法均报耐药的肺炎克雷伯菌作为试验对象。判断标准按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI) 2017年标准执行，质控菌株大肠埃希菌ATCC25922。

1.2.2最低抑菌浓度(MIC)测定 采用琼脂稀释法，对倍连续稀释亚胺培南、美罗培南、氨苄西林、左氧氟沙星、阿米卡星、头孢他啶、头孢吡肟等7种抗菌药物，测定可疑产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的7种药物MIC值。

1.2.3改良Hodge试验 用无菌生理盐水制备0.5号麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922悬液作为指示菌，10倍稀释后按常规纸片法药敏试验操作MHA平板，自然干燥10 min，在平板中心贴厄他培南纸片(10 μg/片)。挑取3～5个血平板上过夜培养的待测菌和质控菌株的菌落，从纸片边缘向外划一条至少25 mm的直线，孵育后观察结果，待测菌株与抑菌环交叉处出现矢状生长的为产碳青霉烯酶阳性株[3]。

1.2.4碳青霉烯酶基因及其他β-内酰胺酶基因引物设计 参照文献[4]设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，碳青霉烯酶基因及其他β-内酰胺酶基因引物序列见表1。

表1 β-内酰胺酶基因引物

1.2.5碳青霉烯酶基因及其他β-内酰胺酶基因的PCR扩增与测序 改良Hodge试验阳性菌株，采用煮沸法提取细菌基因组DNA。PCR反应总体积为50 μL，包括上、下游引物各1 μL，PCR Magic Mix 25 μL,DNA模板5 μL(5 ng)，用双蒸水(ddH2O)补充至50 μL。循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，紫外凝胶电泳成像仪下观察并拍照。PCR阳性产物送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，测序结果进行BLAST比对分析。

2 结 果

2.123株CRKP临床分布情况 CRKP分布广泛，23株CRKP检出的临床科室为神经外科(12株，占52.17%)、重症监护病房(ICU,3株，占13.04%)、普外科(2株，占8.70%)、干部病房(2株，占8.70%)、泌尿外科(1株，占4.35%)、骨科(1株，占4.35%)、五官科(1株，占4.35%)、眼科(1株，占4.35%)。神经外科与ICU共占65.21%，重症患者CRKP检出较高。

2.2CRKP临床标本分布情况 23株CRKP中，16株(69.57%)为痰标本，5株(21.74%)来源于分泌物或脓液，1株(4.35%)为血液标本，1株(4.35%)为中段尿标本。其中痰标本占近70%，而从无菌体液中检出CRKP具有重要意义。

2.323株CRKP的最低抑菌浓度(MIC) 氨苄西林MIC为64～4 096 μg/mL，阿米卡星MIC为1～2 048 μg/mL，亚胺培南MIC为1～1 024 μg/mL，美罗培南MIC为1～1 024 μg/mL，头孢他啶MIC为64～2 048 μg/mL，头孢吡肟MIC为64～2 048 μg/mL，左氧氟沙星MIC为0.5～512.0 μg/mL。临床检出23株CRKP对临床常用抗菌药物的MIC。

2.4改良Hodge试验结果 23株CRKP改良Hodge试验结果均为阳性。

2.5临床分离CRKP碳青霉烯酶基因检测结果 23株CRKP中21株携带blaKPC-2基因，其电泳图见图1。PCR扩增产物经测序、BLAST比对分析，证实为blaKPC-2基因。

注：M为DNA Marker,自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；N为阴性对照；1～6泳道为试验菌株。

图1 blaKPC-2基因电泳图

2.6其他β-内酰胺酶基因检测结果 对21株产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，同时检测其他β-内酰胺酶基因，结果显示19株携带blaKPC-2基因同时携带blashv-1基因，2株携带blaKPC-2基因同时携带blashv-1、blactx-m-15基因。blashv-1、blactx-m-15基因电泳图见图2、3。

注：M为DNA Marker，自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；P为阳性对照，N为阴性对照；泳道1～3为试验菌株。

图2 blashv-1基因电泳图

注：M为DNA Marker,自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；N为阴性对照；泳道1～3为blaKPC-2试验菌株，泳道4～5为blactx-m-15试验菌株。

图3 blactx-m-15基因电泳图

3 讨 论

近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用、侵袭性操作应用等原因，细菌性耐药问题成为全球医学界共同关注的焦点[5]。近几年，长期大量、不规范合理使用碳青霉烯类抗菌药物导致对其耐药的肠杆菌呈逐年发展的趋势[6]。在社区及医院内感染中，肠杆菌科细菌是重要的病原菌，临床上多重耐药菌的出现也使其耐药问题日益严峻[7]。肺炎克雷伯菌检出率在各家医院均处于前5位，是造成医院内感染的重点细菌，其耐药率呈逐年上升的趋势。据全国细菌耐药监测网(CHINET)监测报告，2015-2016年我国肺炎克雷伯对碳青霉烯类的耐药率为14.4%～15.8%[8]，各地区稍有不同，可能与用药方式和习惯有关。本院2017年CRKP检出率为8.2%，根据CHINET监测数据显示，2017年CRKP的检出率平均为9.0%，安徽省细菌耐药监测网显示，安徽省CRKP的检出率平均为17.8%。可见本院肺炎克雷伯菌的耐药情况低于全省，这可能与本院用药情况、用药习惯等有关，今后继续加强用药管理，延缓耐药菌产生。

产生碳青霉烯水解酶是肠杆科细菌碳青霉烯耐药的主要机制[9]。本研究发现，本院23株CRKP均产ESBLs，耐药基因检出情况为19株同时携带blaKPC-2、blashv-1，2株同时携带blaKPC-2、blashv-1、blactx-m-15，与宫雪等[2]报道相似。提示本院CRKP的主要耐药机制可能是KPC-2型碳青霉烯酶同时联产SHV-1型酶。另2株未检出KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，其耐药机制后续将继续研究。

本研究中CRKP分布广泛，在临床能引起多个部位感染，主要分离自痰标本，占各类标本的69.57%，这些细菌来自不同科室，而临床主要来源于神经外科和ICU这些重症患者，占总分离率的65.21%，与国内报道一致[10]。经国内一些专家研究证实，CRKP可以在重症病房与普通病房间传播，是导致肺炎克雷伯菌耐药性不断上升及CRKP检出率逐年提高的主要原因。

综上所述，为预防CRKP检出率上升，有效控制医院内感染的发生，应积极配合医院感染部门，并与临床进行沟通，做好CRKP的监测与防控工作，以降低产生CRKP风险，为临床治疗肺炎克雷伯菌导致的感染提供帮助。