驴乳溶菌酶原核表达及活性检测

张 伟，罗时华，王长法，岳寿松，齐鹏飞，朱曼玲，张 燕*

（1. 山东省农业科学院 生物技术研究中心，山东 济南 250100；2. 山东省农业科学院 畜牧兽医研究所，山东 济南 250100；3. 聊城毛驴高效繁育与生态饲养研究院，山东 聊城 252000）

溶菌酶（Lysozyme）又称胞壁质酶（Muramidase），能水解细菌细胞壁的肽聚糖使其细胞壁松散、裂解、胞内物质溢出而起到杀菌作用。溶菌酶还能与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白等形成复盐，使病毒失活。它还能够与抗σ因子—RsiV 结合，激活σV[1]。溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、提高机体免疫力、无残留等特点，是一种有前景的抗生素替代品[2-3]。

按照来源不同，溶菌酶可分为3 类：动物溶菌酶、植物溶菌酶和微生物溶菌酶。动物溶菌酶是来源最广和数量最多的一种溶菌酶，包括c 型（Chick⁃en type）、g 型（Goose-type）和i 型（Invertebrate-type）溶菌酶。哺乳动物中仅存在c 型和g 型溶菌酶，其中驴包含2 个g 型溶菌酶和6 个c 型溶菌酶[4]。庄桂龙等对驴乳溶菌酶研究显示，马属动物（马、驴）和少量动物（猫、狗等）具有特有的c 型溶菌酶基因LY⁃SC1，该基因在驴乳腺中高表达[4]，导致驴乳中溶菌酶含量达1.1 g/L[5]。驴乳中的高含量溶菌酶可能是驴乳体细胞数量远远小于牛乳体细胞数量的原因。目前，关于驴溶菌酶特性的研究较少，因此，本研究人工合成驴乳溶菌酶基因（donkey LYSC1，DKLY⁃SC1），构建了原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）经诱导表达，测定其表达产物活性，为驴溶菌酶的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 pET32a（+）原核表达载体由本实验室保存；pUC59 载体由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；T4 DNA 连接酶、Nco I 和Xho I 限制性内切酶均购自TaKaRa 公司；T5 Super PCR Mix 购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；His 标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）、兔抗His 标签多克隆抗体、HRP 标记羊抗兔IgG 和高灵敏度化学发光检测试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；溶菌酶测试盒（比浊法）购自南京建成生物工程研究所；其它常规试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 DKLYZC1 基因序列及引物的设计与合成 参考GenBank 登录的驴DKLYSC1 基因序列（XM_014850098），人工合成目的基因全长序列（两端分别带有Nco I 和Xho I 酶切位点），克隆于pUC59 载体，构建pUCDKLYSC1 重组质粒。PCR 鉴定引物：DKLYSC1-F：5'-atgaggtccactctgatcat-3'/DKLYSC1-R：5'-tcacaggttac agctagccaggt-3'，预期扩增产物大小为447 bp。目的基因和鉴定引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 pET32a-DKLYSC1 原核表达载体构建及诱导表达 pUC-DKLYSC1 质粒经Nco I 和Xho I 双酶切，将目的片段亚克隆于pET32a（+）载体，构建原核表达载体pET32a-DKLYSC1。经PCR 和酶切鉴定后，由青岛擎科生物科技有限公司测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，获得pET32a-DKLYSC1/DE3 菌株。参照文献[6]进行目的蛋白诱导表达及SDS-PAGE 电泳检测。

1.4 重组DKLYSC1 蛋白纯化及western blot 鉴定将诱导表达6 h 的pET32a-DKLYSC1/DE3 菌体超声破碎，离心收集包涵体沉淀，并参照His 标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）方法纯化DKLYSC1 蛋白。随后以兔抗His 标签多克隆抗体（1∶1 000）为一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶3 000）为二抗进行目的蛋白的western blot 鉴定。

1.5 重组DKLYZ C 蛋白驴源溶菌酶比酶活的测定参照文献[7]透析复性法进行重组蛋白复性，具体操作稍加改动，整个透析过程使蛋白液中L-精氨酸浓度保持0.8 mol/L、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）按1∶1 摩尔量混合，终浓度保持3 mmol/L。

透析液上清即为复性蛋白。利用超滤管浓缩复性蛋白至复性前包涵体蛋白体积后进行12%SDS-PAGE 检测。利用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定重组溶菌酶蛋白含量，利用溶菌酶测试盒（比浊法）测定重组溶菌酶的酶活力，重组溶菌酶的酶活力与重组溶菌酶蛋白含量的比值即为该重组溶菌酶的比酶活（U/mg）。

2 结果与讨论

2.1 pET32a-DKLYSC1 原核表达载体构建和鉴定结果 pUC59-DKLYSC1 经Nco I 和Xho I 双酶切后，将获得的目的片段克隆至原核表达载体pET32a（+），构建重组质粒pET32a-DKLYSC1。构建的重组质粒经PCR 扩增结果显示，在450 bp 左右获得与目的片段大小一致的条带（图1A）；该质粒经Nco I 和Xho I 双酶切后获得5 900 bp 左右的载体片段和450 bp 左右的DKLYSC1 基因片段（图1B）。测序结果显示插入片段与DKLYSC1 基因序列完全一致，表明pET32a-DK⁃LYSC1 原核表达载体正确构建。本研究采用人工合成DKLYSC1 基因序列，一方面因为DKLYSC1 仅447 bp，且人工设计两端添加酶切位点简便易行，合成成本低；另一方面因为人工合成基因序列高保真，避免了PCR 扩增片段时的碱基突变问题。

图1 pET32a-DKLYZC1 载体的PCR 鉴定（A）及酶切（B）鉴定Fig.1 Identification of pET32a-DKLYZC1 vector by PCR and restriction enzyme digestion

2.2 重组蛋白表达的分析 将鉴定正确的pET32a-DKLYSC1转化BL21（DE3）感受态细胞，获得pET32a-DKLYSC1/DE3 重组菌株。经IPTG 诱导表达、SDSPAGE 检测。结果显示，重组菌在31 ku 处有目的蛋白条带，与重组DKLYSC1 蛋白预期分子量大小一致，并且蛋白表达量随诱导时间的延长逐渐提高，6 h 时达到最大值。菌体超声破碎后离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE 检测重组蛋白表达形式，结果显示重组蛋白主要存在于沉淀中，表明重组蛋白主要以包涵体形式表达（图2A）。目前，不同来源的溶菌酶基因在大肠杆菌和酵母菌表达系统、植物及动物乳腺中均获得了表达[8-11]。大肠杆菌原核表达系统是应用最广泛的经典蛋白表达系统，具有目的蛋白表达水平高，生长周期短，抗污染能力强，安全性好和成本低等特点[12]。溶菌酶对大肠杆菌有一定的毒害作用，表达产物若为可溶性蛋白极易产生大肠杆菌的“自杀”现象，而以包涵体形式的表达则可避免其对重组菌株生长性能的影响。

重组蛋白N 端带有His 标签，利用Ni 柱参照包涵体蛋白纯化方法获得纯化的重组包涵体蛋白。western blot 检测结果显示，在31 ku 处出现特异性条带（图2B）。表明重组蛋白DKLYSC1 具有较强的反应原性。将纯化的重组蛋白利用尿素法进行透析复性，获得了纯度高的复性蛋白，但浓度较复性前降低。本研究中驴乳溶菌酶在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，但溶菌酶中含有4 个二硫键，复性过程中二硫键能否正确排列和蛋白结构能否正确折叠是获得高活性溶菌酶的关键。本研究在复性过程中加入了赖氨酸和谷胱甘肽氧化还原对来促使重组驴乳溶菌酶的复性，复性效率有所提高。

图2 重组蛋白DKLYSC1 表达的SDS-PAGE 检测（A）及纯化蛋白的westen blot 鉴定（B）Fig.2 Identification of recombinant DKLYSC1 by SDS-PAGE and verification of purified DKLYSC1 by western blots

2.3 重组蛋白比酶活测定 根据BCA蛋白浓度测定方法获得复性后重组溶菌酶蛋白含量为0.308 mg/mL，依据比浊法测定重组溶菌酶活性为38.42 U/mL，经计算，重组溶菌酶比酶活为124.74 U/mg。

本实验获得的溶菌酶比酶活相对较低，究其原因，可能是复性条件中，其二硫键未能正确排列，虽获得可溶性重组蛋白但其特有的蛋白酶功能却下降了。因此，随后将针对驴乳溶菌酶包涵体蛋白的复性条件进一步研究，以期获得最佳的包涵体复性条件和高活性重组蛋白。

我国驴业是独具特色的优势产业，也是世界各国驴业发展中产业链最为完善的，涉及养殖、屠宰、畜产品加工等各个方面，其中阿胶制品是最为熟知的驴制品。但是，随着机械化发展进程，驴的役用功能下降，我国驴存栏量也呈现急剧下滑的现象。近年来，国家畜牧业发展结构调整以及政策的支持，驴产业迎来了新的契机，驴养殖业也得到了很大发展，规模化驴场相继建成。驴耐粗饲、不易生病，具有良好的环境适应性和较强的抗逆性的特性，但随着集约化驴养殖业的发展，疫病防控存在风险。溶菌酶具有杀菌、抗病毒等活性，本研究开展驴乳溶菌酶的研究，不仅对驴基因资源的开发利用具有重要意义，同时对驴基础学科研究和探究更安全、高效和稳定的抗生素替代产品用以防控驴的相关疫病具有重要的现实意义。