CVC1302 对O 型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的免疫增强作用

侯立婷，陈 瑾，于晓明，乔绪稳，张元鹏，郑其升*，侯继波*

（1. 江苏省农业科学院 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouse disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。该病传播途径多、速度快，是危害畜牧业最严重的传染病之一[1]。该病曾多次在世界范围内发生大流行，国际兽医局将其列为必须通报的烈性传染病[2]。FMDV病毒粒子无囊膜，衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4 4种结构蛋白组成，其中VP1 蛋白暴露在病毒粒子表面，含有可诱导感染动物产生中和抗体的主要抗原表位，是FMD 新型疫苗研究最多的结构蛋白[3-5]。研究发现O 型FMDV 的5 个抗原位点中有3 个位于VP1结构蛋白上，主要的B 细胞表位为aa141～aa160，其能够诱导机体产生体液免疫应答[6]。两个辅助性T细胞表位分别为T1（aa21～aa35）和T2（aa200～aa213），其能够增强Th 细胞的活性，并同时协同诱导机体产生抗病毒抗体[7]。本实验前期选取FMDV VP1 结构蛋白上的B、Th 细胞表位进行亚单位疫苗的设计，利用实验室可溶性表达平台进行蛋白的可溶表达，利用革兰氏阳性增强基质（GEM）表面展示系统对其进行纯化，构建了细菌样颗粒（Bacterial like parti⁃cles，BLP）疫苗GEM-B（T1BT2）4B[8]。GEM 表面展示系统由GEM 颗粒和蛋白锚钩（Protein anchor，PA）构成，研究证实，与PA 融合表达的目标蛋白可以展示在GEM 颗粒的表面，以GEM 为骨架形成BLP抗原。GEM 颗粒易于保存、稳定性好、可以刺激机体产生强烈的免疫应答，并且该系统操作简单[9-11]。

免疫增强剂CVC1302（ZL 201310042983.0）是由国家兽用生物制品工程技术研究中心免疫技术研究室自行研制，该增强剂经过大量实验证明，可以显著提高各类FMD 疫苗免疫效力，而且能够延长抗体的持续期[12]。本实验将免疫增强剂CVC1302 与GEM-B（T1BT2）4B 混合乳化制成疫苗，免疫小鼠和仔猪，通过评价其免疫效力，为FMD BLP 疫苗的研制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 BLP 疫苗GEM-B（T1BT2）4B 及表达用载体pQZ-PA，由本实验室构建制备[8]；MTT、PHA 购自南京生兴生物科技有限公司；4 周龄的ICR 小鼠购自扬州大学比较医学中心；45 日龄FMD 抗体阴性仔猪，由国家兽用生物制品工程技术研究中心试验猪场提供；FMDV VP1 ELISA 试剂盒购自上海优耐特生物医药有限公司；O 型FMD 液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；商品化FMD 合成肽疫苗[批号：（2014）090297522]由国家兽用生物制品工程技术研究中心提供；佐剂为实验室自购的白油、司本、吐温；免疫增强剂为CVC1302 由本实验室购买、配制。

1.2 动物分组与免疫

1.2.1 小鼠免疫实验 4周龄的ICR小鼠50只，随机划分为5 组，每组10 只，分别标记为A、B、C、D、E组。A 组 为GEM-B（T1BT2）4B 组；B 组 为GEM-B（T1BT2）4B与免疫增强剂CVC1302配合使用组；C组为pQZ-PA 转化的E. coli 对照组；D 组为PBS 空白对照组；E组为商品化FMD合成肽疫苗对照组。

免疫增强剂CVC1302（50 μg/只）先与GEM-B（T1BT2）4B 混合再与白油佐剂按1∶2 乳化制苗。以0.2 mL/只皮下多点注射进行免疫，免疫后21 d 加强免疫一次，分别于免疫后的21 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d 采集血清用于FMDV VP1 结构蛋白抗体检测。

1.2.2 猪免疫实验 45 日龄FMD 抗体阴性仔猪50头仔猪随机划分为5 组，每组10 头，分别标记为I、II、III、IV、V 组。I 组 为GEM-B（T1BT2）4B组； II 组 为GEM-B（T1BT2）4B 与 免 疫 增 强 剂CVC1302 配合使用组；III 组为pQZ-PA 转化的E.coli对照组；IV 组为PBS 空白对照组；V 组为商品化FMD 合成肽疫苗对照组。

免疫增强剂CVC1302（1 mg/头）先与GEM-B（T1BT2）4B 混合后，再与白油佐剂按1∶2 混合乳化制苗。采用肌肉注射的方式进行免疫，免疫剂量为2 mL/头，免疫后28 d 加强免疫一次，分别于0、28 d、56 d 采集血清用于液相阻断抗体ELISA 检测。1.3 血清IgG 抗体检测 按照免疫程序采取小鼠及仔猪血清，分离后的血清按照FMDV VP1 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试剂盒和O 型FMD 液相阻断抗体ELISA 检测试剂盒说明书测定其血清抗体。

1.4 小鼠淋巴细胞增殖检测 免疫后第35 d，每组随机取3 只免疫小鼠，采用断颈方式迫杀，先用0.5%新洁尔灭溶液对小鼠全身进行消毒，再用75%酒精消毒。无菌采取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用含10%（v/v）新生牛血清的RPMI-1640 完全培养液调整细胞浓度约为2×107个/mL，加入96 孔细胞板内，100 μL/孔，每个样品做3 个重复，向各孔内加入5 μg 人 工 合 成 的 猪O 型FMDV GH loop 表 位 多 肽（VP1 aa141～aa160 位AA）作为刺激抗原，同时设PHA 作为阳性对照组，2 μg/孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养60 h，每孔加入5 μg/mL 的MTT 10 μL，继续培养4 h。测定OD490nm值，取3 个平均值计算刺激指数（SI），试验设不加FMD 抗原的营养液作为阴性对照。以SI 作为判断淋巴细胞转化程度的参数，SI=刺激孔OD492nm值/阴性对照孔OD492nm值。

1.5 小鼠细胞因子检测 免疫后第35 d，每组随机取3 只免疫小鼠，采用断颈方式迫杀，取相同质量的免疫小鼠脾脏研磨，反复冻融3 次，用TRIzol 裂解法提取RNA，利用一步反转试剂盒获得cDNA。根据GenBank 中登录的相关序列设计引物（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，参考文献[13]的方法利用荧光定量PCR 检测小鼠脾脏中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的基因转录水平。

表1 实验用引物序列Table1 Primers used in this study

2 结 果

2.1 FMDV VP1 结构蛋白特异性抗体检测 利用FMDV VP1 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试剂盒检测免疫增强剂CVC1032 的免疫增强作用。结果显示，小鼠首次免疫后21 d，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302组的IgG 抗体水平高于其他免疫组；GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组与合成肽疫苗组在免后第42 d 抗体水平达到最高，第49 d开始小幅度下降，两组抗体水平差异不显著（p＞0.05）。GEM-B（T1BT2）4B 组免后抗体水平上升缓慢，与GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组相比，抗体水平差异显著（p＜0.05）（图1）。表明免疫增强剂CVC1032 能够增强GEM-B（T1BT2）4B 诱导的小鼠免疫反应。

2.2 仔猪对疫苗的免疫应答反应 利用O 型FMD液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒检测仔猪血清液相阻断抗体水平，根据OIE 制定的参考标准，血清抗体滴度＞1∶64 判为阳性，＜1∶40 判为阴性。结果显示，首免后56 d，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组与合成肽组能够产生高水平的液相阻断抗体。GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组 的10 头 猪 的 抗 体 水 平 均在1∶128 以上，GEM-B（T1BT2）4B 组的抗体水平为1∶73.5。GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组抗体水平显著高于B（T1BT2）4B 组（p＜0.01），与合成肽免疫组抗体水平差异不显著（p＞0.05）（图2）。表明CVC1302能够增强GEM-B（T1BT2）4B 的免疫原性，并且能够显著提高免疫猪的抗体水平。

图1 FMDV VP1 结构蛋白抗体检测结果Fig.1 Detection of antibodies against FMDV VP1 structural protein in mice using ELISA

图2 猪血清液相阻断抗体滴度Fig.2 Antibody titers in swine detected with LPB ELISA kit

2.3 淋巴细胞增殖试验结果 采用MTT 法对小鼠脾脏淋巴细胞进行检测。结果显示，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组小鼠加强免疫后14 d 淋巴细胞增殖指数达到3.15±0.06，统计学分析结果显示，与商品化的人工合成肽疫苗所引发的T 细胞增殖反应差异不明显（p＞0.05），与GEM-B（T1BT2）4B 组差异极显著（p＜0.01）（图3）。表明免疫增强剂CVC1302能够引起特异性的淋巴细胞增殖反应。

2.4 细胞因子检测结果 分离免疫后35 d 的小鼠脾脏，提取RNA，参考文献[13]的方法采用荧光定量PCR 方法检测IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表达水平。结果显示，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 组小鼠的IFN-γ 与IL-4 的表达水平显著高于GEM-B（T1BT2）4B 组（p＜0.01），与合成肽疫苗组差异不显著（p＞0.05）。所有实验组IL-10、TNF-α水平变化均不显著（p＞0.05）（图4），表明CVC1302 免疫增强剂能够诱导小鼠产生明显的Th1 型免疫反应。

图3 疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖检测结果Fig.3 T-cell proliferation responses in the mice after BLP vaccine immunization

图4 免疫小鼠相关细胞因子检测结果Fig.4 Detection of cytokines for immunized mice at 35 days post primary vaccination

3 讨 论

疫苗接种是预防和控制FMD 的可靠手段。FMD液相阻断ELISA 抗体是公认的检测指标，且液相阻断ELISA 抗体水平与攻毒保护有一定的相关性，抗体滴度越高，保护率越高[14]。FMDV VP1 结构蛋白的aa141～aa160 和aa200～aa213 是FMDV 的 主 要 中 和表位，许多FMDV 表位疫苗的研究均含有这两个主要的抗原表位，并且均有较好的免疫效果[15-16]。王长怡将O 型FMDV VP1 蛋白aa141～aa160 位肽段和一个具有广谱性的辅助T 细胞表位进行化学合成，将其制备疫苗免疫猪后可以抵抗104.5TCID50FMDV 的强毒攻击[17]，且已经形成商品化疫苗。但多肽的化学合成生产成本较高，本研究利用本实验室前期构建的O 型FMD BLP 疫苗配合免疫增强剂CVC1302 进行动物免疫试验，不仅能够提高VP1 结构蛋白特异性抗体，而且能够提高液相阻断ELISA 抗体的水平；且方法操作简便，生产成本低廉。

免疫增强剂CVC1302 含有多种TLR 受体的激动剂，能够显著提高机体的先天性免疫反应，提高并延长疫苗抗原的免疫效力[18]。研究表明，提高机体的细胞免疫水平对于预防FMDV 的感染具有重要的意义，高水平的细胞免疫反应对FMDV 感染初期降低FMD 发病率具有重要的意义[19-20]。添加免疫增强剂CVC1302 的BLP 疫苗能够显著提高IL-4、IFN-γ的表达水平，这可能将会对增强机体的抗病毒感染能力具有一定的作用。

传统的FMD 灭活疫苗在FMD 的防控中发挥了重要的作用。2012 年国务院办公厅发布实施的《国家中长期动物疫病防治规划》中将FMDV 的净化纳入了该规划，迫切需要能够代替传统灭活苗的安全有效的疫苗，而亚单位疫苗通常以重组纯化蛋白或多肽为基础，在生物安全方面明显优于传统疫苗，但免疫原性稍有不足。综上所述，免疫增强剂CVC1302和O型FMDVBLP 疫苗联合使用能够显著增强机体的体液和细胞免疫反应，为我国FMD 的清除提供新的思路，为FMD 亚单位疫苗的发展提供新的借鉴。